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簡(jiǎn)介：第六章個(gè)別細(xì)胞和組織的培養(yǎng)類型正常細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)正常細(xì)胞培養(yǎng)正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都不易生長(zhǎng)，建立細(xì)胞系更難。正常細(xì)胞難培養(yǎng)的原因是它們是分化的細(xì)胞，對(duì)體外生存條件要求嚴(yán)格但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。一、上皮細(xì)胞類培養(yǎng)上皮細(xì)胞可來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層；培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)。上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn)①需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于細(xì)胞生長(zhǎng)；②需求特殊培養(yǎng)基；③與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，并常壓過(guò)上皮細(xì)胞。純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。一表皮細(xì)胞培養(yǎng)1特點(diǎn)在有膠原的底物上易生長(zhǎng)；把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層用射線照射后上時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、CA2的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。向培養(yǎng)基中加氫化可的松10ΜGM1、106M的異丙基腎上腺素ISOPROTERENOL和10NGM1促表皮生長(zhǎng)因子EGF能促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)?！撅暭?xì)胞】飼細(xì)胞FEEDERCELLS也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。飼細(xì)胞作用有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力。飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成?？寺⌒纬珊箫暭?xì)胞漸死亡，換液時(shí)清除。飼細(xì)胞的制備1取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按103細(xì)胞毫升重新接種培養(yǎng)；2在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備025ΜGML的絲裂霉素，按2UG105細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞GY；3細(xì)胞經(jīng)上述處理后，HANKS液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按5104ML接種入新培養(yǎng)基中；448小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。2表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序1取材取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成051CM2小塊；2EDTA處理先置入002％EDTA中室溫置5分鐘。3冷消化換入025胰蛋白酶中，置4℃過(guò)夜；4分離取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)；5溫消化取出表皮單獨(dú)處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的025％胰蛋白酶中，37℃再消化3060分鐘；6制細(xì)胞懸液用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；7加培養(yǎng)液通過(guò)80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入EAGLE液和20％小牛血清8培養(yǎng)接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。注意事項(xiàng)冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身也已松散，此時(shí)亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過(guò)第二次消化。二胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)適于胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件是①膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；②應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；③制備含有特定成分的培養(yǎng)基；培養(yǎng)程序1取材取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端非病變區(qū)粘膜少許；2清洗用含慶大霉素400ΜGM1和兩性霉素2ΜGM1的HANKS液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1MM大??；3消化在I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于37℃中消化80分鐘；4離心收集細(xì)胞懸液，800轉(zhuǎn)分離心后，HANKS液漂洗兩次；5接種末次離心后加入含有1％2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā＜?xì)胞接種后一般在16小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長(zhǎng)，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持23周，第一周末達(dá)高峰，最后逐漸衰退剝落。三肝細(xì)胞培養(yǎng)肝臟具有取材方便和易于生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。1初代組織塊培養(yǎng)肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成1MM3左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長(zhǎng)力好，一般次日即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。2初代消化法培養(yǎng)1把肝組織切成24立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS液洗兩次；2移入11的01％胰蛋白酶和01％膠原酶都用無(wú)鈣鎂BSS配制中，4℃冷消化1012小時(shí)后，通過(guò)250微米和64微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)用紗布濾過(guò)亦可；3收集細(xì)胞、BSS液洗12次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)；3肝臟灌流法需用全肝，以較小動(dòng)物如小鼠和大鼠為好。1無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用BSS洗除血污；2取5ML注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時(shí)輕柔壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中；消化液在肝內(nèi)停留2030分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；3待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)較其它培養(yǎng)基為好，能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。四內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用材料人臍帶臍靜脈、動(dòng)物大動(dòng)脈等，用灌流消化法獲取細(xì)胞最為簡(jiǎn)便。1取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超過(guò)12小時(shí)；無(wú)菌剪取長(zhǎng)1015厘米一段。其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；2先用三通注射器吸溫PBS液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流；3用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為01％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化310分鐘；4吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫PBS沖洗23次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中離心；5吸除上清，加1640培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時(shí)23天內(nèi)細(xì)胞即可長(zhǎng)成單層。人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長(zhǎng)后，一般傳67代后即衰退，難以長(zhǎng)期維持。用兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳1030代；不同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，對(duì)各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。五毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)毛細(xì)血管細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較多的結(jié)締組織，進(jìn)行分離培養(yǎng)有很大困難。近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織如卵巢癌等均可；1材料腫瘤條件培養(yǎng)基制備1取C3H小鼠的S180實(shí)體肉瘤組織；2胰蛋白酶消化，DULBECCO改良EAGLE氏培養(yǎng)液15M1含10％小牛血清種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；3在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基；44000轉(zhuǎn)／分離心后，再通過(guò)022ΜM微孔濾膜濾過(guò)，20℃凍存?zhèn)溆门R用前融解。凝膠底層制備1取60MMFALCON產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1DIFCO產(chǎn)明膠用不合鈣和鎂的HANKS液配制，鋪蓋瓶底，形成薄層；2置4℃過(guò)夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。2初代培養(yǎng)1取材取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用HANKS液洗除血污；2消化剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成LMM3小塊，加05％膠原酶室溫中消化1小時(shí)；每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；3過(guò)濾通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允許能通過(guò)小于110微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段；4離心650RPM，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶；5再離心沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；6制細(xì)胞懸液末次沉淀物仍用含10％小牛血清的DULBECCO改良EAG1E氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；7接種接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭13小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂??；8換液吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液；每?jī)商鞊Q液一次。毛細(xì)血管小段一般成自14個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)25天。3毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)1初代培養(yǎng)23天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；2鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中、打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)1520分鐘；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮刮除；3用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；4剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小520個(gè)細(xì)胞而少時(shí)，生長(zhǎng)增殖常變得緩慢或完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為4000細(xì)胞／CM2；5當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；6接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)飼細(xì)胞死亡被淘汰，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)匯合后，按15傳代。二、結(jié)締組織類細(xì)胞培養(yǎng)一成纖維細(xì)胞培養(yǎng)包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時(shí)的副產(chǎn)物，極易獲得。用人或動(dòng)物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對(duì)象。小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件125145D胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；最佳培養(yǎng)基為DMEM添加15小牛血清；第3代細(xì)胞增殖最旺盛；室溫條件下，0125胰蛋白酶消化時(shí)間以810MIN為宜。在培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇第35代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。小鼠成纖維細(xì)胞；細(xì)胞來(lái)源SWISS小鼠胚胎二巨噬細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長(zhǎng)期生存，好的條件下僅能生活23周，因之多用作初代培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞也能建成無(wú)限細(xì)胞系；大多來(lái)自小鼠，如P388D1、J774A1、RAW309、CR1等。1培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)來(lái)源和取材巨噬細(xì)胞可來(lái)源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。實(shí)驗(yàn)多從動(dòng)物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動(dòng)物腹腔取材最常用。用40ΜG的PHA注入腹腔中，能產(chǎn)生68106個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)刺激性，效果較好。2培養(yǎng)方法培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來(lái)源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用。人的材料除來(lái)源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。程序1實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫基乙酸肉湯1ML勿注入腸內(nèi)；2引頸殺死動(dòng)物；手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中35秒；3置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開(kāi)皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；4再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10MLEAG1E液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)；5用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；6小心拔出針頭，把液體注入離心管中，4℃離心10分鐘后，去上清，加10MLEAGLE培養(yǎng)基；7計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生2030106細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞；8為獲取3105個(gè)貼附細(xì)胞／平方厘米，需接種25106／M1；9為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用EAGLE液沖洗12次后，再加新EAGLE培養(yǎng)液置37℃CO2溫箱中培養(yǎng)。三、肌組織細(xì)胞培養(yǎng)以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實(shí)用。一骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常用生后12天的乳鼠WISTAR大鼠更好。1取材殺死動(dòng)物，無(wú)菌取大腿肌組織，切成0305厘米小塊；2消化用不含鈣鎂離子的HANKS液配的025％胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，合成培養(yǎng)基加10％小?；蝰R血清培養(yǎng)，為促進(jìn)分化可加1％的胎汁；3接種細(xì)胞接種量為2106皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。明膠制備比較簡(jiǎn)單，常用HANKS液配的001％明膠。生長(zhǎng)特點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)5052小時(shí)后將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象；因收縮運(yùn)動(dòng)有時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞從底物脫離。二心肌細(xì)胞培養(yǎng)最常用材料雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)的組織，可應(yīng)用多種方法進(jìn)行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取心室肌培養(yǎng)，均能獲得良好的生長(zhǎng)效果。程序1選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度；每日翻動(dòng)一次180度，孵育912天；2取雞胎；3用眼科剪剪開(kāi)胸腔，剝出心臟，置入皿中用HANKS液漂洗12次；4小心剪除大的動(dòng)靜脈，保留心室肌；用組織塊或消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，純化及生長(zhǎng)特點(diǎn)常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；心肌細(xì)胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在培養(yǎng)成功時(shí)，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）組成。神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對(duì)生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長(zhǎng)出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元有共存關(guān)系。人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞大鼠C6膠質(zhì)細(xì)胞一初代培養(yǎng)神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長(zhǎng)突起，但因無(wú)增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細(xì)胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。二傳代培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。三培養(yǎng)方法人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來(lái)自手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1程序1細(xì)胞懸液制備獲取腦組織后，先仔細(xì)剝除腦膜和血管等纖維成分，置入HANKS液中漂洗12次后，置于3050倍的HANKS液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細(xì)胞懸液；2排除脂肪成分和其它碎塊把懸液注入離心管中，在室溫直立510分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細(xì)胞成分；3濾過(guò)、計(jì)數(shù)、接種向末次沉降物中加入適量營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置5％C02溫箱中培養(yǎng)；4傳代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，可用025％胰蛋白酶消化法做傳代處理。2生長(zhǎng)特點(diǎn)接種后初期，細(xì)胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，然而一旦生長(zhǎng)后，即能進(jìn)入較旺盛的增殖狀態(tài)。生長(zhǎng)開(kāi)始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞第二節(jié)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。一、要點(diǎn)1取材人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。2培養(yǎng)基腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMIL640、DMEM、MCCOY5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。3成纖維細(xì)胞的排除成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。成纖維細(xì)胞排除法1機(jī)械刮除法是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用也可用特制電熱燒灼器刮除。刮除程序?yàn)?標(biāo)記鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；2刮除棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；3用HANKS液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；5注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。2反復(fù)貼壁法根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，1細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，HANKS沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；2編號(hào)為A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；3B瓶中細(xì)胞520分鐘后，按處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。3消化排除法1先是用05％胰蛋白酶和002％EDTA11混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；2把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落，經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。4膠原酶消化法本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。1可用05MG／ML的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；2用HANKS洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞末被除凈，可再次重復(fù)。5其它方法有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重10251085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800G離心10分鐘。在比重10251050層為成纖維細(xì)胞，在比重10651085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。二、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施1適宜底物如把經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。2生長(zhǎng)因子應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長(zhǎng)物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長(zhǎng)因子。3動(dòng)物體媒介培養(yǎng)為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞干細(xì)胞的數(shù)量，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。HELA細(xì)胞肝癌細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞株MCF7

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簡(jiǎn)介：不同類型牙列缺損的固定橋設(shè)計(jì)LOGO修復(fù)前檢查及設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)2019715牙列缺失患者口腔局部條件的差異較大，根據(jù)固定橋的適應(yīng)癥范圍，結(jié)合患者的具體情況，如缺牙數(shù)目，缺牙部位，基牙條件，預(yù)留牙情況，缺牙區(qū)牙槽嵴的情況等，進(jìn)行綜合分析，首先確定是選擇固定橋修復(fù)，還是可摘局部義齒修復(fù)。對(duì)某些牙列缺損的患者而言，選擇固定或可摘修復(fù)形式并沒(méi)有絕對(duì)的界限，患者可以擁有一定的選擇余地。設(shè)計(jì)類型1、雙端固定橋支持的合力較大，兩端基牙承受合力較均勻，對(duì)牙周健康有利。如果無(wú)特殊情況，應(yīng)盡量采用雙端固定橋。2、由于固定橋共同就位道的獲得存在不同的難度，單端固定橋受力時(shí)，基牙受到較大的扭力，不利于基牙牙周健康，故應(yīng)慎重選用單端固定橋設(shè)計(jì)，能夠采用短固定橋時(shí)，盡量不要設(shè)計(jì)較復(fù)雜的長(zhǎng)固定橋。3、種植修復(fù)的應(yīng)用，使不少牙列游離缺損患者獲得了較為理想的固定修復(fù)。上、下合牙單個(gè)牙缺失兩個(gè)牙連續(xù)缺失兩個(gè)牙間隔缺失三個(gè)牙或多個(gè)牙缺失（一）單個(gè)牙缺失的固定橋設(shè)計(jì)1、1|缺失常以2|1做基牙，設(shè)計(jì)雙端固定橋。如果2支持力量比較弱，1缺牙間隙較大，固定橋受力時(shí)，容易引起2|1受創(chuàng)傷導(dǎo)致基牙松動(dòng)。此時(shí)應(yīng)增加基牙數(shù)，以32|1做基牙。20197152、2|缺失2缺失以3|1做基牙，設(shè)計(jì)雙端固定橋較合理。因3|1基牙所能承擔(dān)的合力遠(yuǎn)大于缺失牙修復(fù)橋體受力后傳遞至兩端基牙上的合力。如2缺牙間隙小，承受合力較輕，而3|1的牙根長(zhǎng)大，也可設(shè)計(jì)3為基牙的單端固定橋，但應(yīng)注意調(diào)整咬頜。20197153、3|缺失設(shè)計(jì)比較困難，因2|的冠根均小而短，而3|位于牙弓轉(zhuǎn)彎處，承受的合力較大，因此一般不選擇42|做基牙。只有2|的支持條件很好，3|的缺牙間隙小，覆合較小時(shí)才用42|做基牙。如選用421|做基牙，磨除牙體組織過(guò)多。如以54|做基牙，設(shè)計(jì)單端固定橋，可將54|固位體制作成固定連接，增加固定橋的固位和穩(wěn)固性。但設(shè)計(jì)單端固定橋修復(fù)時(shí)，必須考慮減輕單端固定橋橋體所承受的合力，并仔細(xì)檢查咬合時(shí)的接觸關(guān)系及調(diào)整。20197154、4|或5|缺失設(shè)計(jì)雙端固定橋。當(dāng)64|做基牙修復(fù)5|缺失時(shí)，應(yīng)考慮6|在牙列中的支持力最強(qiáng)，使64|固位體的固位力能接近，4|的固位體必須有良好的固位形20197155、6|缺失較常見(jiàn)的，一般設(shè)計(jì)75|做基牙的雙端固定橋，但必須注意5|上固位體固位形的設(shè)計(jì)如果7|近中傾斜，但很堅(jiān)固，也可設(shè)計(jì)半固定橋在5|的遠(yuǎn)中作活動(dòng)連接，橋體采用盡可能減輕合力的設(shè)計(jì)。20197156、7|缺失如果8|存在，8|牙冠形態(tài)比較正常，可設(shè)計(jì)86|做基牙的雙端固定橋。如8|缺失或體積過(guò)小，牙冠短，也可考慮設(shè)計(jì)65|為基牙的單端雙基牙固定橋。此設(shè)計(jì)必須縮小7|的近遠(yuǎn)中徑和頰舌徑，減小固定橋在承受合力時(shí)的杠桿力作用，恢復(fù)缺失牙的部分咀嚼功能，可防止對(duì)頜牙伸長(zhǎng)。但在作7|缺失的單端固定橋修復(fù)時(shí)，必須慎重。2019715（二）兩個(gè)或多個(gè)牙缺失的固定橋設(shè)計(jì)兩個(gè)或多個(gè)牙缺失的類型很多，而且缺牙區(qū)鄰牙的情況也各不一樣。必須結(jié)合具體情況進(jìn)行分析。修復(fù)的目的不僅要恢復(fù)缺失牙的功能，還要有利于保護(hù)余留牙的健康。1、1|1缺失若1|1缺失后，缺隙較小，前牙咬合接觸不緊或無(wú)接觸，2|2的牙周和牙體條件較好，可設(shè)計(jì)雙端固定橋。1|1可設(shè)計(jì)雙端固定橋。2、21|缺失常設(shè)計(jì)31|為基牙的雙端固定橋。3、32|缺失上頜41|1或541|1為基牙的雙端固定橋。下頜設(shè)計(jì)41|1雙端固定橋。20197154、43|缺失可以設(shè)計(jì)521|為基牙的雙端固定橋。5、54|缺失上頜如3|的的牙冠條件較好，可設(shè)計(jì)63|為基牙的雙端固定橋。下頜設(shè)計(jì)632|為基牙的雙端固定橋。6、65|缺失設(shè)計(jì)743|為基牙的雙端固定橋。7、76|缺失如果8|的條件差或者缺失，均不宜設(shè)計(jì)固定橋修復(fù)。即使8|能夠做基牙，458|為基牙修復(fù)67|的固定橋在支持和固位方面還不能達(dá)到要求，不宜采用。（三）兩個(gè)牙的間隔缺失1、42|的間隔缺失，可選用53|為基牙的復(fù)合固定橋，或者設(shè)計(jì)以531|為基牙的復(fù)合固定橋，3為中間基牙，能分擔(dān)兩端基牙的負(fù)荷。20197152、52|缺失，最好設(shè)計(jì)以64|為基牙和以31|為基牙的兩端固定橋；也可以設(shè)計(jì)346為基牙的復(fù)合固定橋。而后者的設(shè)計(jì)比較理想，從牙周膜面積計(jì)算來(lái)看，基牙的牙周膜面積總和明顯大于缺失牙的牙周膜面積總和，有足夠的支持合力的能力，同時(shí)從保護(hù)牙體組織角度，減少1|作基牙。在制作固定橋時(shí)，可將34|作固定連接和6|形成雙端固定橋修復(fù)5|，2|缺失以34|的固位體作基牙形成單端固定橋。20197153、53|缺失，可以設(shè)計(jì)為以642|為基牙的固定橋，如果2|的條件差，再追加1|為基牙，但這種設(shè)計(jì)需要的基牙多損傷大。上頜4、63|缺失，可以設(shè)計(jì)為754|為基牙的復(fù)合固定橋（下頜）2019715（四）三個(gè)或多個(gè)牙的缺失1、牙弓后段的三個(gè)牙連續(xù)缺失一般情況下不考慮設(shè)計(jì)固定橋修復(fù)。2、上頜21|1缺失，如選用32做基牙，基牙的牙周膜面積小于缺失牙。而且2的支持力和固位力均遠(yuǎn)不如3，因此不能以32做基牙修復(fù)2L1缺失。故可以設(shè)計(jì)以3|23為基牙的雙端固定橋。3、上頜21|2缺失，可以設(shè)計(jì)31|3為基牙的雙端固定橋。20197154、21|12缺失，上頜如果咬合關(guān)系正常，缺牙間隙不大，3|3的固位、支持條件好，可設(shè)計(jì)3|3為基牙的雙端固定橋；如果合力大，3|3的條件差，應(yīng)設(shè)計(jì)以43|34為基牙的雙端固定橋。下頜如果缺失間隙不大，3|3的固位、支持條件好，可設(shè)計(jì)以3|3為基牙的雙端固定橋，但需謹(jǐn)慎。5、下頜21|124缺失，通?？稍O(shè)計(jì)以3|35為基牙的復(fù)合固定橋。

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