云南蘿芙木酶PNAE基因全長(zhǎng)齋克隆及其序列分析.pdf

1、蘿芙木屬植物是一類(lèi)重要的藥用植物，在其中已發(fā)現(xiàn)多達(dá)200種吲哚生物堿，吲哚生物堿被用來(lái)治療多種疾病。吲哚生物堿阿嗎靈就是其中最復(fù)雜的一個(gè)藥用生物堿，它包含了一個(gè)含有九個(gè)手性碳原子的高度復(fù)雜的六元環(huán)，阿嗎靈代謝包含超過(guò)10個(gè)不同的步驟，而polyneuridinealdehydeesterase(PNAE)酶就恰恰處在該酶系系列的中間部分，催化polyneuridinealdehyde(PNA)轉(zhuǎn)化為epi-vellosimine的關(guān)鍵步

2、驟，PNAE酶的反應(yīng)速率對(duì)阿嗎靈合成代謝中起到了一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前，在云南蘿芙木中未見(jiàn)有關(guān)于PNAE酶基因克隆的報(bào)道，因此，對(duì)云南蘿芙木中PNAE酶基因的克隆對(duì)提高阿嗎靈的產(chǎn)量具有深遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義，本論文的主要研究結(jié)果如下:
　　 1)在NCIB生物信息學(xué)網(wǎng)站上搜索PNAE酶的相關(guān)蛋白質(zhì)和mRNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)比對(duì)軟件比對(duì)得到的蛋白質(zhì)和mRNA全長(zhǎng)序列，獲得PNAE酶cDNA序列可能的大致保守區(qū)域，然后根據(jù)已知的其

3、他物種PNAE酶cDNA序列來(lái)設(shè)計(jì)PCR引物，采用RT-PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室溫室中栽種的云南蘿芙木上取新鮮的葉片，提取高質(zhì)量的總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)后PCR擴(kuò)增獲得pnae基因部分cDNA序列即PNAE酶基因中間保守大片段，最后利用RACE技術(shù)來(lái)進(jìn)行5’和3'RACE實(shí)驗(yàn)以獲取PNAE酶基因中間保守大片段兩端的序列。通過(guò)拼接獲得的三段序列我們得到了完整的1004bp的PNAE酶基因cDNA全長(zhǎng)序列。
　　 2)根據(jù)獲得的pnae

4、基因cDNA全長(zhǎng)序列，分析得到795bp的開(kāi)放閱讀框，編碼264個(gè)氨基酸。進(jìn)一步的序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，云南蘿芙木中PNAE酶氨基酸序列與蛇根木中的該酶氨基酸序列同源性高達(dá)90％，但和其他植物物種中的PNAE酶氨基酸序列，以及其他物種間的PNAE酶氨基酸序列同源性都不高在40％-60％之間，表明不同物種中PNAE酶氨基酸序列不具有全序列的高度同源性。
　　 3)再進(jìn)一步序列分析表明，在各植物的PNAE酶氨基酸序列中都存在兩個(gè)高度保守