DADS對DJ-1核定位高表達人白血病HL-60細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的:研究二烯丙基二硫（DADS）對DJ-1核定位高表達人白血病HL-60細胞生物學行為的影響，闡明DJ-1在細胞核內的功能，為腫瘤在臨床診斷及治療過程中提供一個潛在的治療靶點或有效藥物。
　　方法:通過lipo fectamine2000脂質體介導的基因轉染技術，將攜帶有DJ-1基因細胞核定位表達質粒pCMV/myc/nuc-EGFP-DJ-1轉染至人白血病HL-60細胞中， G418篩選出穩(wěn)定DJ-1核內高表達HL-60細胞系

2、，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光信號，Western blot檢測轉染前后DJ-1蛋白在細胞漿、核內表達情況。轉染成功后實驗分三組：對照組（HL-60細胞）、空載體組及高表達組（DJ-1核定位高表達HL-60細胞），利用軟瓊脂集落形成實驗、MTT法、流式細胞術、間接免疫熒光細胞化學實驗、硝基藍四氮唑（NBT）還原比色實驗、Giemsa染色法、Transwell遷移侵襲小室實驗及Western blot檢測DADS對HL-60細胞增殖、周期、分

3、化、遷移侵襲能力及核內DJ-1蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1.成功建立穩(wěn)定DJ-1核內高表達的HL-60細胞系。
　　測序結果證實，DJ-1基因的細胞核定位表達質粒pCMV/myc/nuc-EGFP-DJ-1的插入序列與DJ-1全長cDNA的GenBank序列完全一致。熒光顯微鏡觀察高表達組細胞中可見綠色熒光信號。Western blot檢測高表達組細胞核內DJ-1蛋白的表達量明顯增高，提示成功穩(wěn)定的DJ-1核內

4、高表達HL-60細胞株。
　　2.DADS對DJ-1細胞核內高表達的HL-60生物學行為的影響。
　　MTT法顯示：DADS作用前，高表達組細胞生長能力明顯高于對照組和空載體組細胞（P<0.05）。DADS作用后，三組細胞的增殖能力明顯減弱，且高表達組細胞增值抑制率明顯低于對照組和空載體組（P<0.05）。提示DADS具有抑制DJ-1核內高表達的HL-60細胞增殖的作用，并且DJ-1核內高表達可促進HL-60 細胞

5、增殖及降低DADS對HL-60細胞增殖抑制的作用。
　　軟瓊脂集落形成實驗顯示：DADS作用前，高表達組細胞的相對集落形成率明顯高于對照組和空載體組（P<0.05），DADS作用后，三組細胞相對集落形成率均減低（P<0.05）。提示DJ-1核內高表達可以促進HL-60細胞增殖，DADS具有抑制DJ-1核內高表達HL-60細胞增殖的作用。
　　流式細胞術檢測顯示：DADS作用前，高表達組細胞S期百分率高于對照組和空載體組（P<

6、0.05），高表達組細胞 G1期細胞百分率明顯低于對照組和空載體組（P<0.05），提示DJ-1核內高表達可促進HL-60細胞增殖作用。DADS作用后，三組細胞G1期百分率均明顯提高（P<0.05），S期均明顯降低（P<0.05）， DADS作用后出現(xiàn)G1期細胞阻滯，提示DADS具有誘導HL-60細胞分化的能力。
　　間接免疫熒光細胞化學實驗顯示：DADS作用前，CD11b在三組細胞表面呈弱表達，CD33在高表達組的表達量明顯高于

7、對照組和空載體組；DADS作用后，三組細胞CD11b的表達明顯提高，CD33的表達明顯降低，提示DJ-1核內高表達可以抑制HL-60細胞分化，DADS具有誘導DJ-1核內高表達HL-60細胞分化的作用。
　　NBT還原反應實驗：DADS作用前，高表達組細胞的還原率明顯低于對照組和空載體組（P<0.05）；DADS作用后，三組細胞的還原率均明顯升高（P<0.05），提示DJ-1核內高表達可以抑制HL-60細胞分化，DADS具有誘導D

8、J-1核內高表達HL-60細胞分化的能力。
　　Giemsa染色法顯示：與DADS作用前相比，DADS作用后，三組細胞開始出現(xiàn)分化現(xiàn)象，細胞體積減小，核出現(xiàn) U型、腎型和分葉改變，核漿比例降低，細胞核的染色變淺等。
　　遷移實驗顯示：DADS作用前，高表達組細胞遷移率明顯高于對照組和空載體組（P<0.05）；DADS作用后，三組細胞遷移能力均明顯減弱（P<0.05），提示DJ-1核內高表達可以促進HL-60細胞遷移，DADS

9、具有抑制HL-60細胞遷移的作用。
　　侵襲實驗顯示：DADS作用前，高表達組細胞穿膜數(shù)較對照組和空載體組明顯增多（P<0.05）；DADS作用后，三組細胞穿膜數(shù)明顯減少，侵襲能力均明顯減弱（P<0.05），提示DJ-1核內高表達可以促進HL-60細胞侵襲，DADS具有抑制DJ-1核內高表達HL-60細胞侵襲的能力。
　　3.DADS對DJ-1核內高表達HL-60細胞核內DJ-1表達的影響
　　Western blot

10、檢測：與DADS作用前相比，DADS作用后，三組細胞核內DJ-1蛋白均明顯減少（P<0.05），提示DADS（1.25 mg·L-1）具有抑制HL-60細胞核內DJ-1蛋白表達的能力。
　　結論：
　　1.DJ-1核定位高表達具有促進HL-60細胞增殖和遷移侵襲及抑制HL-60細胞分化的作用。
　　2.DADS可以誘導DJ-1核定位高表達的HL-60細胞分化及抑制遷移侵襲。
　　3.DJ-1核定位高表達可減弱DA