接頭蛋白Gab1通過PI3K-AKT信號通路調節(jié)bFGF誘導的血管生成.pdf

1、目的：
　　探討生長因子受體結合蛋白2相關的接頭蛋白1（Gab1）在堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）誘導的血管內皮細胞形成新生血管過程中的作用及分子機制，為周圍動脈閉塞性疾病的基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　利用小干擾RNA-慢病毒載體技術轉染人臍靜脈血管內皮細胞融合株（Eahy926）細胞，特異干擾 Eahy926細胞 Gab1基因，并通過實時熒光定量PCR和蛋白電泳的方法驗證所構建的LV-Gab1-siR

2、NA載體能否成功干擾Eahy926細胞Gab1蛋白的表達。Western blot檢測pAKT、AKT的表達量確定bFGF作用于Eahy926細胞的最佳刺激濃度和時間?；|膠小管形成實驗直觀觀察接頭蛋白Gab1對bFGF誘導Eahy926細胞形成血管狀結構的影響，進一步通過蛋白電泳檢測細胞增殖與分化下游信號通路蛋白pGab1、AKT、pAKT等蛋白的表達情況，研究其信號通路轉導機制。
　　結果：
　?、賅estern blo

3、t結果顯示在bFGF終濃度為30ng/ml時Eahy926細胞pAKT蛋白條帶最清楚，與其他濃度組相比，AKT活化百分數(shù)最高。
　?、赪estern blot結果顯示在bFGF終濃度為30ng/ml、刺激時間為30min時Eahy926細胞pAKT蛋白條帶最清楚，與其他刺激時間組相比，AKT活化百分數(shù)最高。
　?、墼诘怪脽晒怙@微鏡下對比熒光視野和明視野表明在MOI值為100時，Eahy926細胞高表達綠色熒光蛋白。
　

4、?、軐崟r熒光定量PCR結果顯示Gab1 siRNA組Eahy926細胞Gab1 mRNAs表達明顯減少。
　?、莼|膠小管形成實驗結果表明Gab1 siRNA組Eahy926細胞小管形成長度明顯較短，且所形成的網(wǎng)狀結構簡單且多不完整。
　?、轜estern blot檢測下游信號通路蛋白分子結果示：Gab1 siRNA組pAKT條帶明顯較模糊，AKT活化百分數(shù)明顯降低。
　　結論：
　?、袤w外bFGF刺激Eahy9