重組腺病毒介導PUMA基因治療胰腺癌的實驗研究.pdf

1、胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與多種基因異常有關。胰腺癌手術切除率低，傳統(tǒng)的治療效果差，有待于探討新的治療方法。近年來發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制在胰腺癌的發(fā)病機制中起重要作用，因此，通過增加細胞內促凋亡蛋白的表達來誘導細胞凋亡是胰腺癌治療的有效措施之一。 PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的具有較強的促凋亡作用的P53下游基因，是公認的抑癌基因。PUMA在許多惡性腫瘤中表達缺失或低表達，PUMA低表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，并且恢復細胞內P

2、UMA表達具有明顯的腫瘤生長抑制作用。本課題旨在探討PUMA在胰腺癌中的表達及意義及PUMA基因在胰腺癌中的作用。 第一部分、PUMA在胰腺癌組織中的表達及臨床意義 目的：研究胰腺癌組織中PUMA蛋白表達與臨床病理因素的關系，初步探討PUMA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：應用免疫組化Envision方法檢測60例胰腺導管癌組織石蠟標本中PUMA，Bcl—2和蛋白表達以及19例正常胰腺組織石蠟標本中PUMA蛋白

3、表達，RT—PCR、Western blotting檢測進一步證實免疫組化的檢測結果。TUNEL檢測細胞凋亡，分析PUMA表達與臨床病理學指標的關系以及PUMA與AI、P53、Bcl—2表達的相關性。 結果：PUMA在胰腺癌組織中的陽性率為30%（18/60），低于正常胰腺組織90%（17/19），差異有顯著性（P=0．002）； RT—PCR、Western blotting檢測證實了免疫組化結果；PUMA表達與腫瘤大小（P<

4、0．05），淋巴結轉移（P<0．05）和遠處轉移有關（P<0．05），而與腫瘤分化程度和TNM分期無關（分別P>0．05）；在PUMA陽性和陰性表達的腫瘤組織中，細胞凋亡指數（AI）分別17．63%±6．27%和13．44%±5．86%，差異有顯著性（p<0．05）；在PUMA陰性表達的腫瘤組織中的細胞凋亡指數明顯低于正常胰腺組織（16．12%±5．72%），差異有顯著性（p<0．05）； P53和Bcl—2在胰腺癌中的表達率分別為46

5、．7%（28/60）和41．7%（25/60），PUMA與P53和Bcl—2表達分別有顯著的負相關性（p=0．013和P=0．046）。 結論：胰腺癌細胞凋亡抑制及腫瘤轉移與PUMA蛋白表達缺失有關，PUMA可能是胰腺癌預后的判斷指標和基因治療的靶點。 第二部分、胰腺癌細胞CAR受體表達與5型腺病毒轉導效率的關系 目的：通過體外、體內實驗探討胰腺癌腫瘤細胞CAR表達水平與腺病毒轉導效率的關系，為腺病毒相關的生物制

6、劑在胰腺癌患者個體化應用提供實驗依據。 方法：先將載有綠色熒光蛋白的Ad5型腺病毒（Ad—GFP）以100MOI分別感染人胰腺癌細胞系AsPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細胞6～96h，再以20～1000 MOI的Ad—GFP感染AsPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細胞24 h。感染結束后分別通過流式細胞術檢測Ad—GFP在不同細胞系的轉導效率。采用Western blotting、免疫組

7、化方法檢測這些細胞中CAR的表達水平。將CaPan—1、BxPC—3細胞分別接種于裸鼠背部，接種細胞數分別為5×106，建立裸鼠移植瘤模型。待腫瘤長徑達10mm時，在裸鼠移植瘤內注射Ad—GFP1×108 pfu，試驗分2組，第一組：1—14天內動態(tài)觀察腫瘤內熒光的變化，第二組：3天處死裸鼠，剖取瘤組織，熒光顯微鏡觀察冰凍切片中GFP的表達情況以判定腺病毒在瘤體內的轉導效率，同時western blot法檢測瘤組織內的CAR表達水平。

8、 結果：4種細胞的轉染效率在24小時最高，AsPC—1、CaPan—1細胞在MOI50時，轉染效率近100%，Panc—1細胞在200MOI時轉染效率接近100%，而BxPC—3在MOI1000時，轉染效率為60%。各種細胞的CAR蛋白表達水平與腺病毒的轉導效率呈正相關。在注射Ad—GFP的裸鼠移植瘤組織中，3天可見CaPan—1瘤組織內有明顯的綠色熒光，而BxPC—3瘤組織內熒光強度少于前者；14天后熒光完全消失。冰凍切片發(fā)現(xiàn)C

9、aPan—1細胞內明顯點狀熒光，而BxPC—3細胞熒光較弱。CAR在CaPan—1移植瘤組織的表達高于BxPC—3移植瘤組織，表明瘤體內CAR表達水平與Ad—GFP的轉導效率也呈正相關。 結論：體內外實驗均顯示腫瘤細胞的CAR表達水平與5型腺病毒轉導效率密切相關，胰腺癌患者治療前檢測組織中CAR表達水平有助于規(guī)范腺病毒載體的基因治療藥物個體化使用 第三部分、攜帶PUMA基因的重組腺病毒（Ad—PUMA）的構建及制備

10、 目的：構建含有人PUMA的重組腺病毒，為下一步轉染人胰腺癌細胞研究奠定基礎。 方法：以重組質粒pCEP4—PUMA中提取的PUMA基因為模板，采用PCR法擴增基因片段。將擴增的基因片段插入穿梭質粒pShuttle—CMV，并轉化大腸肝菌BJ—5183。篩選重組質粒pShuttle—CMV—PUMA，與pAdEasy—1一起電轉化BJ5183細胞。篩選重組腺病毒質粒pAdEasy—PUMA，用Lipofectamine轉染29

11、3細胞，制備攜帶人PUMA基因的重組復制缺陷型腺病毒（Ad—PUMA）。氯化銫密度梯度離心法純化Ad—PUMA病毒顆粒，并測定病毒滴度。 結果：①經限制性內切酶酶切，證實Ad—PUMA構建成功②限制性內切酶酶切確定穿梭質粒重組于病毒骨架；顯微鏡下觀察HEK293細胞形態(tài)，證實病毒包裝復制成功③病毒滴度2．032×1010pfu/ml，達到進一步體內、外實驗要求。 結論：成功構建了重組腺病毒Ad—PUMA，為了解PUMA在

12、胰腺癌中的治療作用奠定基礎。 第四部分、Ad—PUMA治療胰腺癌的體外研究 目的：探討Ad—PUMA對體外胰腺癌細胞的凋亡促進作用和生長抑制作用 方法：以不同MOI值的Ad—PUMA作用AsPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細胞，MTT檢測PUMA對細胞增殖的影響，PI染色、DNA Ladder、流式細胞儀檢測PUMA對細胞凋亡的影響；Western blotting檢測細胞內PUMA蛋白表達的

13、變化以及Bax、Bcl—2、細胞色素C、Caspase—9，3表達的影響，流式細胞儀檢測細胞內Caspase活性 結果：Ad—PUMA抑制胰腺癌細胞系細胞增殖和生長，并且PUMA抑制胰腺癌細胞生長表現(xiàn)出時間依賴性和劑量依賴性，但PUMA對不同胰腺癌細胞的生長抑制作用并不相同，在相同條件下，Aspc—1細胞的生長抑制最明顯，而BxPC—3的生長抑制不明顯。DNA Ladder、FCM、PI染色分析檢測到明顯的Ad—PUMA誘導的細

14、胞凋亡。Western blotting發(fā)現(xiàn)，在PUMA表達上調的同時，細胞內Bax、Bcl—2、細胞色素C、Caspases蛋白表達也隨著變化，caspases酶的活性明顯提高。 結論：PUMA通過促進凋亡而抑制胰腺癌細胞生長，PUMA通過線粒體途徑發(fā)揮作用． 第五部分、Ad—PUMA治療胰腺癌的體內研究 目的：探討Ad—PUMA對體內胰腺癌細胞的生長抑制作用。 方法：建立裸鼠AsPC—1胰腺癌模型，待

15、瘤體生長到10mm左右。治療前一天，移植腫瘤局部注射Ad—PUMA1×108PUF/ml/50ul，第3d注射第二次，第6d注射第3次，從治療前一天開始測量腫瘤體積，每2d測量一次至第21天。在治療21天，TUNEL檢測細胞凋亡、免疫組化檢測ki67了解細胞增殖，western blotting和RT—PCR檢測細胞PUMA表達的變化。 結果：在實驗組，腫瘤生長明顯減慢，21天后的腫瘤的體積明顯低于對照組，而細胞內PUMA表達明

16、顯高于對照組；實驗組細胞增殖受抑制，細胞凋亡指數增加。 結論：Ad—PUMA轉染促進體內腫瘤細胞凋亡并抑制其生長。 第六部分、Ad—PUMA聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌的體內研究 目的：探討Ad—PUMA聯(lián)合吉西他濱對體內外胰腺癌細胞生長的影響。 方法：將AsPC—1細胞分別暴露于系列濃度的吉西他濱或系列濃度吉他西濱聯(lián)合5MOIAd—PUMA48h，MTT法測定細胞的存活率。按照上述方法建立裸鼠AsPC—1胰腺

17、癌模型，待瘤體生長到10mm左右，吉西他濱、Ad—PUMA或兩者聯(lián)合治療移植瘤。于0、3、6天，腫瘤局部注射Ad—PUMA1×109PUF/ml/50ul，吉他西濱的給藥方式為腹腔注射，劑量為100mg/kg，于0、3、6天給藥。從治療前一天開始測量腫瘤體積，2d測量一次至21天。 結果：吉他西濱以劑量依賴方式抑制AsPC—1細胞增殖，但吉他西濱聯(lián)合Ad—PUMA后對AsPC—1細胞增殖的抑制更加明顯，聯(lián)合后的IC50為（0．0