人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖作用及機(jī)制探討.pdf

1、造血功能障礙是惡性腫瘤化學(xué)藥物治療和大劑量放射線治療、放射源意外泄漏和核戰(zhàn)爭(zhēng)條件下急性放射損傷的主要并發(fā)癥之一。其中，巨核細(xì)胞損傷導(dǎo)致的血小板減少除輸注血小板外，尚缺乏有效的治療手段。血小板生成素(thrombopoietin，TPO)作為刺激巨核細(xì)胞增殖和血小板生成的重要細(xì)胞因子仍存在治療后產(chǎn)生抗凝血抗體、加重出血的危險(xiǎn)性。如何安全有效地促進(jìn)血小板數(shù)量和功能的恢復(fù)，尚需探索。 造血微環(huán)境(hematopoieticinduct

2、ivemicroenvironment，HIM)是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，具有促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化、成熟產(chǎn)板的作用。因此，從修復(fù)或重建骨髓造血微環(huán)境正常功能入手治療巨核細(xì)胞損傷，是一個(gè)值得探索的領(lǐng)域。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(humanbonemarrowstromalcells，hBMSCs)是造血微環(huán)境的主要成分，自1977年Dexter在體外培養(yǎng)出骨髓基質(zhì)細(xì)胞獲得成功后，人們對(duì)BMSCs進(jìn)行了深入的研究。目前，骨髓基質(zhì)細(xì)

3、胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增聯(lián)合造血干細(xì)胞回輸經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證是重建造血功能損傷的有效方法。由于自體移植中患者自身造血微環(huán)境異常，而異體移植又存在組織相容性的問(wèn)題，限制了骨髓基質(zhì)細(xì)胞在臨床上的廣泛運(yùn)用。人臍血中的細(xì)胞成分豐富且較骨髓和外周血更原始，具有來(lái)源廣泛，采集方便，免疫原性弱和長(zhǎng)期造血重建的特點(diǎn)，已成為新的造血干細(xì)胞來(lái)源。本課題組長(zhǎng)期從事人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(humanumbilicalcordblood-derivedstromalcells，h

4、uCBDSCs)及臍血造血微環(huán)境的研究，前期研究經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得hUCBDSCs，證明其具備造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特征和造血調(diào)控功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層的體外擴(kuò)增體系促進(jìn)巨核細(xì)胞集落(colonyformingunit-megakaryocte，CFU-Meg)形成的作用明顯優(yōu)于hBMSCs，提示hUCBDSCs在促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化方面可能具有特殊的意義，對(duì)其作用特點(diǎn)和機(jī)制的深入研究可為巨核細(xì)胞損傷修復(fù)治療提供新的思路

5、。 鑒于此，本課題在構(gòu)建巨核細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)模型和裸鼠造血微環(huán)境損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察hUCBDSCs體外促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖和體內(nèi)重建造血微環(huán)境、促進(jìn)巨核細(xì)胞生成和血小板數(shù)量恢復(fù)的作用。從TPO途徑、SDF-1途徑和間隙連接細(xì)胞間通訊三個(gè)方面深入探討hUCBDSCs促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖和移植裸鼠血小板恢復(fù)的可能機(jī)制，為安全有效促進(jìn)血小板功能和數(shù)量恢復(fù)提供新的輔助治療措施。 方法： 1.觀察人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促

6、進(jìn)巨核細(xì)胞系HEL增殖的體外研究 實(shí)驗(yàn)分組：①HEL細(xì)胞懸浮培養(yǎng)組；②HEL細(xì)胞/hBMSCs共培養(yǎng)組；③HEL細(xì)胞/hIJCBDSCs共培養(yǎng)組。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察HEL細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的位象關(guān)系；CCK8法繪制HEL細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEL細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡壞死情況，透射電鏡觀察HEL細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 2.觀察人臍血源基質(zhì)細(xì)胞移植重建造血微環(huán)境促進(jìn)巨核細(xì)胞生成的在體研究 對(duì)裸鼠實(shí)施不同輻照劑量照射

7、，觀察裸鼠輻照后不同時(shí)相點(diǎn)血象、骨髓象、CFU-F等指標(biāo)變化，探索適宜本研究的造血微環(huán)境損傷動(dòng)物模型的輻照劑量。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定5.0Gy作為造血微環(huán)境損傷動(dòng)物模型的輻照劑量；實(shí)驗(yàn)分組：①生理鹽水組；②hBMSCs組；③hUCBDSCs組。觀察不同移植組造血微環(huán)境重建和巨核細(xì)胞、血小板數(shù)量恢復(fù)情況。動(dòng)態(tài)觀察CM-DiI標(biāo)記hUCBDSCs裸鼠體內(nèi)遷移情況。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

8、3.1TPO途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖中的作用 ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)hBMSCs和hUCBDSCs培養(yǎng)上清TPO濃度；激光共聚焦、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞C-mpl蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)HEL細(xì)胞C-mplmRNA表達(dá)水平。 3.2SDF-1途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖中的作用 ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)hBMSCs和hUCBDSCs培養(yǎng)上清SDF-1濃度；激光共聚焦、流式細(xì)胞儀

9、檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)HEL細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)水平。 3.3間隙連接細(xì)胞間通訊在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖中的作用 熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞間通訊功能；激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和hUCBDSCsCx43蛋白表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和hUCBDSCsCx43mRNA水平表達(dá)情況。透射電鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和h

10、UCBDSCs細(xì)胞連接處超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡觀察，HEL細(xì)胞粘附在hUCBDSCs表面，呈球形，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HEL細(xì)胞數(shù)量逐漸增多；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HEL細(xì)胞可通過(guò)偽足粘附于hUCBDSCs表層，或龕于hUCBDSCs融合所形成的“網(wǎng)眼”中，甚至移行到hUCBDSCs層下，部分hUCBDSCs胞膜突起與多個(gè)HEL細(xì)胞粘附，形成“放射狀”排列。HEL細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示HEL/hUCBDSCs組細(xì)胞生長(zhǎng)速度

11、最快；細(xì)胞周期結(jié)果顯示HEL/hUCBDSCs組S+G2/M期細(xì)胞比例最高(P＜0.05)，突顯出hUCBDSCs在巨核細(xì)胞增殖中的特殊促進(jìn)作用。凋亡率結(jié)果顯示三組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 2。裸鼠接受不同劑量輻照所表現(xiàn)出來(lái)的血象變化程度不同，5.0Gy組裸鼠有明顯骨髓抑制和CFU-F計(jì)數(shù)降低，且在照射后自行恢復(fù)，是裸鼠造血微環(huán)境損傷的理想輻照劑量。移植裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：基質(zhì)細(xì)胞有明顯的促進(jìn)血小板恢復(fù)的作用，其中hUC

12、BDSCs作用最強(qiáng)。采用CM-DiI標(biāo)記hUCSDCs移植裸鼠，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：hUCSDCs在肝臟、脾臟和肺臟組織間隙短暫“停留”后，迅速“歸巢”至骨髓重建損傷造血微環(huán)境。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖的機(jī)制研究 3.1ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示hUCBDSCs分泌表達(dá)TPO水平明顯高于hBMSCs，分泌高峰稍遲于hBMSCs，傳代后hUCBDSCs培養(yǎng)上清中的TPO濃度仍高于hBMSCs。流式細(xì)胞儀和激

13、光共聚焦檢測(cè)均顯示其C-mpl蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)；RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞c-mplmRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示無(wú)顯著性差異； 3.2ELISA結(jié)果顯示：體外液體培養(yǎng)前6天，hUCBDSCs和hBMSCsSDF-1分泌水平相當(dāng)，6天后hUCBDSCsSDF-1分泌水平明顯高于hBMSCs，傳代后hUCBDSCs培養(yǎng)上清中的sDF-1濃度仍高于hBMSCs；流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測(cè)均顯示與hUCBDSCs和hBMS

14、Cs共培養(yǎng)的HEL細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)明顯減弱，且可在部分HEL細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)紅色點(diǎn)狀熒光；RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示無(wú)顯著性差異； 3.3在本試驗(yàn)條件下，熒光漂白恢復(fù)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示hUCBDSCs和HEL細(xì)胞之間無(wú)明顯熒光物質(zhì)交換，而相互粘連的hUCBDSCs的熒光強(qiáng)度在淬滅后熒光迅速恢復(fù)；激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞Cx43表達(dá)較弱，呈均勻分布，hUCBDS

15、CsCx43表達(dá)較強(qiáng)，可見呈點(diǎn)狀群聚分布的高亮斑塊；RT-PCR檢測(cè)在HEL/hUCBDSCs共培養(yǎng)體系中，HEL細(xì)胞Cx413mRNA的表達(dá)明顯低于hUCBDSCs。 結(jié)論： 1.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖的作用：①生長(zhǎng)曲線--細(xì)胞擴(kuò)增速度加快；②細(xì)胞周期--S+G2/M期細(xì)胞比例明顯增多；③掃描電鏡--可見hUCBDSCs粘附、龕合、包裹HEL細(xì)胞；④透射電鏡--可見大量增殖旺盛的HEL細(xì)胞和核分裂相；

16、 2.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有重建移植裸鼠造血微環(huán)境和促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板數(shù)量和功能恢復(fù)的作用； 3.hUCBDSCs通過(guò)分泌高水平TPO，上調(diào)巨核細(xì)胞C-mpl蛋白的表達(dá)，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖、分化、產(chǎn)板； 4.hUCBDSCs通過(guò)分泌高水平SDF-1，促進(jìn)巨核細(xì)胞的遷移和增殖，在遷移的過(guò)程中巨核細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)降低，形成“內(nèi)吞小泡”，調(diào)控巨核細(xì)胞的遷移； 5.本試驗(yàn)條件下，hUCBDSCs和HEL細(xì)胞間未檢