質粒載體的構建

1、質粒載體的構建摘要：質粒載體的構建。首先要獲得目的DNA。根據(jù)其目的基因序列和啟動子序列設計引物，為提高目的基因產(chǎn)率，采用兩次PCR的方法，即第一次設計引物擴增全序列基因，第二次設計帶酶切位點的引物以第一次擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，進而加尾連接到TDNA上，再利用電轉化的方法將連接產(chǎn)物轉化到帶有PCAMBIA1381的DH5α感受態(tài)細胞中復制表達。關鍵詞：質粒DNAPCR電泳感受態(tài)轉化1.引言質粒（plas）是細菌或細胞染色質以外的，能自

2、主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下：①是染色質外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2300kb之間，＜15kb的小質粒比較容易分離純化，＞15kb的大質粒則不易提取。②能自主復制，是能獨立復制的復制子。一般質粒DNA復制的質粒可隨宿主細胞分裂而傳給后代。③質粒對宿主生存并不是必需的。某些質粒攜帶的基因功能有利于宿主細胞的特定條件下生存，例如，細菌中許多天然的質粒帶有抗藥性基因，如

3、編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質粒稱為抗藥性質粒，又稱R質粒，帶有R質粒的細菌就能在相應的抗生素存在生存繁殖。所以質粒對宿主不是寄生的，而是共生的。現(xiàn)在分子生物學使用的質粒載體都已不是原來細菌或細胞中天然存在的質粒，而是經(jīng)過了許反向引物：sinn3R冰盒標注：P2b引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’引物長度：22bp第二次引物設計（帶酶切位點）：正向引物：sinn3FE冰盒標

4、注：P2c引物序列：5’—ACTGGATCCAAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’引物長度：34bp反向引物：sinn3RE冰盒標注：P2d引物序列：5’—TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’引物長度：34bp2.1.2PCR擴增2.1.2.1PCR技術的基本原理PCR即聚合酶鏈式反應是指在DNA聚合酶的催化下以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點通過變性、延伸、復性等步驟體外復制