24個Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合檢測體系的建立及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、人類Y染色體屬于性染色體，為正常男性所特有，除擬常染區(qū)(pseudoautosomal region，PAR)外，在遺傳過程中不發(fā)生重組，其序列結(jié)構(gòu)除突變外由父代不變的傳遞給子代，同一父系人群的Y染色體在理論上相同。Y染色體的這一特性，使其在法醫(yī)DNA檢驗和親權(quán)鑒定方面有巨大應(yīng)用潛力。同時由于其具有男性特異性，在實際辦案中，對性侵犯、傷害等案件中提取到的男女混合檢材進行鑒定時，Y染色體遺傳標(biāo)記檢驗技術(shù)更有其特殊的價值，能夠獲得男性個體Y

2、染色體遺傳信息同時不受女性成分影響。鑒于以上特點，Y染色體長期以來都是作為重要的研究檢驗對象被應(yīng)用于法醫(yī)物證檢驗。
　　 針對Y染色體第二代遺傳標(biāo)記——短串聯(lián)重復(fù)序列( STR，short tandemrepeats)而進行的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增檢驗，是目前應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的Y染色體遺傳信息檢驗技術(shù)，具有操作簡單、檢測信息通量高、結(jié)果數(shù)字化顯示易于存儲比對等優(yōu)點?；谶@一技術(shù)而開發(fā)的各種商業(yè)化試劑盒，已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗鑒定中

3、得到廣泛應(yīng)用。2003年P(guān)romega公司推出的PowerPlexTMY試劑盒在一個反應(yīng)管中同時擴增12個Y-STRs基因座，其中包括ISFH(International Society of Forensic Haemogenetics)認定的歐洲 MHL(最小單倍型，minimal haplotypes loci)的9個基因座及SWGDAM(美國DNA分析方法科學(xué)工作組,Scientific Working Group On DNA

4、 Analysis Methods)推薦的11個基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM試劑盒，可以實現(xiàn)同步擴增檢測17個Y-STR基因座。但這些現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒主要是按照歐洲人群統(tǒng)計選擇的基因座位點，其中不少基因座的多態(tài)性在中國人群中比較低，如DYS391在中國人群中多態(tài)性小于0.4，加之基因座數(shù)量少，造成了系統(tǒng)整體個體識別能力低，在法醫(yī)鑒定的實際應(yīng)用中有時會遇到瓶頸，特別是近年隨著DNA數(shù)據(jù)庫的發(fā)展

5、，比對樣本基數(shù)的增加，Y-STR作為家系排查的主要比對指標(biāo)，現(xiàn)有Y-STR檢測系統(tǒng)識別率不足的缺點日益突出，影響了其數(shù)據(jù)庫比對效能，出現(xiàn)了如嫌犯與多個不同家系的Y-STR單倍型匹配，造成無法排查的情況，或者由于Y-STR突變，造成家系比對無法確定或誤判的情況。
　　 因此，開發(fā)一種針對中國人群的多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡單和能同時檢測更多基因座的Y-STR檢測體系，成為我國法醫(yī)物證檢驗鑒定的迫切需要。
　　 本文根據(jù)過去

6、十幾年國內(nèi)外針對中國人群Y-STR的研究，選擇針對中國男性的GD(基因多態(tài)性，gene diversity)數(shù)值較高的Y-STR基因座，建立了24個Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增檢測體系，有效提高Y-STR檢測體系對中國人群的鑒別能力和效率，解決了現(xiàn)有Y-STR熒光檢驗試劑盒識別能力不足的難題。
　　 本文通過查閱文獻，從中選取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/

7、b、DYS446、DYS443、DYS587、 DYS527a/b、DYS460、Y—GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS570、DYS444等未在現(xiàn)有商業(yè)試劑盒體系內(nèi)、在中國人群中基因多態(tài)性高(GD＞0.6)、且等位基因跨度較小的基因座21個，考慮到需要與現(xiàn)有商業(yè)試劑盒聯(lián)用，特地加入DYS635和DYS385a/b三個基因座，同時應(yīng)用目前最先進的5色熒光標(biāo)記，將24個基因座分成四組，使用6

8、-FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標(biāo)記，分子量內(nèi)標(biāo)用第五色熒光染料SIZ（橙色熒光，無錫中德美聯(lián)公司）標(biāo)記，組成24個Y-STR基因座復(fù)合擴增體系。隨后通過先對24個基因座的單一擴增條件進行優(yōu)化，在成功地建立了單個基因座擴增條件的基礎(chǔ)上，研究24個基因座復(fù)合擴增PCR反應(yīng)條件，通過實驗確定了復(fù)合擴增體系的循環(huán)參數(shù)、緩沖液離子強度、酶量、復(fù)合擴增反應(yīng)體積以及熒光標(biāo)記引物濃度等，使擴增產(chǎn)物達到平衡、特異的要求，建立穩(wěn)定、均衡的復(fù)合擴增

9、體系，實現(xiàn)同時擴增24個Y-STR基因座。
　　 本文通過編制GeneMapper ID3.2分析文件panel、bins，使用混合單基因座擴增產(chǎn)物方法制作等位基因標(biāo)準(zhǔn)物ladder，使用5色熒光Matrix與SIZ-500內(nèi)標(biāo)，建立了基于ABI基因分析儀的自動毛細管電泳檢驗方法。PCR擴增產(chǎn)物使用3130XL型遺傳分析儀進行電泳檢測，用軟件Foundation data collection收集原始掃描數(shù)據(jù)，GeneMappe

10、r ID3.2進行Y-STR基因分型。對24個Y-STR復(fù)合擴增體系的男性特異性、家系穩(wěn)定性、種屬特異性、靈敏度、人體細胞同一性等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)指標(biāo)進行了實驗研究，進一步驗證了該體系特異性好、性能穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏。
　　 本文應(yīng)用建立的24個Y-STR復(fù)合擴增檢測系統(tǒng)，對146份廣東地區(qū)無關(guān)男性個體進行檢測，同時應(yīng)用AmpFISTR YfilerTM試劑盒進行比較檢測，得到Y(jié)— STR分型數(shù)據(jù)后，用直接計數(shù)法計算各等位基因頻率?；?/p>

11、因多態(tài)性(genediversity，GD)及單倍型多樣性(haplotype diversity，HD)，按公式h=n(1-Σpi2)/(n-1)計算（n為樣本例數(shù)，Pi為等位基因頻率）。并計算累積的GD值(TGD，相當(dāng)于常染色體STR評估指標(biāo)中的累積非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)計算（GDn為各基因座的GD值）。24個Y-STR復(fù)合擴增體系共得到145

12、種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，單位點GD值為0.55(DYS531)～0.96(DYS385a/b)，HD值為0.99972，TGD值為1-1.88E-14; YfilerTM系統(tǒng)的共得到143種單倍型，其中141種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，1種單倍型出現(xiàn)3次，單位點GD值為0.36(DYS389)～0.96(DYS385a/b)，HD值為0.99858，TGD值為1-4.97E-9;24個Y-ST

13、R復(fù)合擴增體系與yfilerTM系統(tǒng)聯(lián)用的共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，HD值為0.99972，TGD值為1-1.066E-20。
　　 研究表明，本文建立的24個Y-STR復(fù)合擴增體系穩(wěn)定、高效、操作簡單易用，特異性強，可滿足日常法醫(yī)物證Y-STR檢驗需要，具有良好的中國人群針對性，系統(tǒng)識別率高于目前最常用的商業(yè)AmpFISTR YfilerTM試劑盒，能夠很好的解決目前Y-STR商業(yè)試