HA-β-TCP-CS-PRF溫敏水凝膠修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：將富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）與一種溫敏型組織工程支架材料—羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA)/β-磷酸三鈣（tertiary calcium phosph-ate，β-TCP)/殼聚糖（chitosan，CS）復(fù)合，構(gòu)建HTCP凝膠，并通過細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其成骨效果。
　　方法：⑴HTCP水凝膠的制備：將10mlCS溫敏凝膠、1mlPRF懸液與直徑為0.25mm的H

2、A和β-TCP（比例為3:7）混和，37℃孵箱15min，混合液凝結(jié)為固態(tài)，成為HA/β-TCP/CS/PRF凝膠（HTCP）。使用PH指示計(jì)進(jìn)行PH值測定。通過傾斜試管的方法觀察HTCP溫敏水凝膠成膠時(shí)間。⑵HTCP水凝膠對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的影響：取第3代BMSCs以105個(gè)/cm2細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組為常規(guī)成骨誘導(dǎo)液中加入新制備的HT CP水凝膠，對照組為常規(guī)成骨誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)8-14天

3、時(shí)，觀察兩組細(xì)胞生長狀態(tài)，3周時(shí)對兩組行ALP染色，并做MTT比色法分析。⑶HTCP水凝膠修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：在24只新西蘭大耳白兔顱頂骨上各制備4個(gè)直徑為6mm的骨缺損區(qū)。4個(gè)缺損區(qū)內(nèi)按植入材料不同分為HTCP水凝膠組，HTC水凝膠組和PRF組，另設(shè)空白對照組，觀察4、8、12周取材。對實(shí)驗(yàn)標(biāo)本行大體觀察，X線觀察， CBCT觀察，HE染色及BMP-2免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果：①獲得的HTCP溫敏水凝膠呈乳白色不透明液

4、態(tài)，HA和β-TCP粉末顆粒懸浮于溶液中。測得PH值為6.5-7左右，在37℃恒溫箱中靜置15分鐘后可凝膠化。②MTT比色法分析BMSCs在HTCP水凝膠中可以正常存活和生長，未見明顯細(xì)胞毒性。ALP染色提示HTCP水凝膠可能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。③大體觀察顯示，各組骨缺損區(qū)新骨生成隨時(shí)間逐漸增多，第4、8周時(shí)，HTCP組的新骨形成量均優(yōu)于對照組，第12周時(shí)，HTCP組與HTC組未見明顯區(qū)別，但優(yōu)于PRF組和空白對照組骨缺損修復(fù)

5、。④影像學(xué)顯示，各組缺損區(qū)透光區(qū)面積隨時(shí)間延長而逐漸減小，術(shù)后4、8周，實(shí)驗(yàn)組透光區(qū)小于對照組。12周時(shí)HTCP組、HTC組、PRF組缺損區(qū)幾乎無透光影，片狀骨融合在一起，密度同周圍骨質(zhì)。⑤HE染色結(jié)果，術(shù)后4-8周 HTCP組，骨小梁，成纖維細(xì)胞等較對照組多。HTC組和PRF組對于引導(dǎo)骨再生的能力差異不明顯，但較空白組對骨缺損的修復(fù)均有促進(jìn)和引導(dǎo)作用。12周時(shí)，HTCP組、HTC組、PRF組均有成熟的新骨與宿主骨融合，優(yōu)于空白對照組。

6、⑥BMP-2免疫組化觀察：第4周，各組BMP-2抗體染色均為明顯陽性，胞漿黃染；第8周， HTCP組BMP-2染色強(qiáng)陽性，其余各組為陽性，胞漿均被染成棕黃色；在12周時(shí)，各組陽性表達(dá)均有所減弱，未見明顯差別。
　　結(jié)論：HTCP水凝膠具有良好的生物相容性并促進(jìn)BMSCs成骨分化，在兔顱骨缺損修復(fù)的早期和中期可取得較好的成骨效果，優(yōu)于單獨(dú)使用HTC或PRF。HTCP水凝膠作為一種溫敏組織工程骨的支架材料可以促進(jìn)骨缺損的愈合修復(fù)，具有