自體富血小板纖維蛋白(PRF)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨具有特殊的致密結(jié)構(gòu),缺乏血管、神經(jīng)、淋巴組織的營養(yǎng)支持,受到創(chuàng)傷、退變、感染及其它因素導(dǎo)致的損傷常常難以自身修復(fù)。目前臨床所使用的各種關(guān)節(jié)軟骨治療方法均存在某些不足之處,如供體來源有限、易繼發(fā)免疫排斥反應(yīng)等,且大多為纖維軟骨修復(fù),新生軟骨沒有優(yōu)良的生物力學(xué)功能,遠期修復(fù)效果差強人意。組織工程與再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,為軟骨的修復(fù)再生與重建提供了新的方法和思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchy

2、mal stem cells,BMSCs)是一種不穩(wěn)定細(xì)胞,能進行無限分裂,增殖能力很強,在不同的誘導(dǎo)條件下可分化成為不同的細(xì)胞,取材簡便、培養(yǎng)技術(shù)成熟、免疫排斥反應(yīng)小,被認(rèn)為是軟骨組織工程中較為理想的種子細(xì)胞之一。關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)過程,主要是在特殊的微環(huán)境下,通過各種生長因子誘導(dǎo)BMSCs分化成軟骨細(xì)胞。單一生長因子誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化效果欠佳且價格昂貴,而聯(lián)合應(yīng)用多種生長因子修復(fù)軟骨的方法逐漸受到重視。富血小板纖維蛋白(pl

3、atelet-rich fibrin,PRF)是由自體血液離心制備而成,以血小板凝膠形式呈現(xiàn),富含高濃度的血小板、多種生長因子和大量的纖維蛋白,其中纖維蛋白與血小板釋放的生長因子以化學(xué)鍵的方式結(jié)合起來,能緩慢釋放生長因子從而延長作用時間。
　　第一部分:自體富血小板纖維蛋白對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響
　　目的:觀察自體富血小板纖維蛋白（PRF)對體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成軟骨分化的影響。方法:兔心

4、臟采血制備PRF,電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。分離培養(yǎng)兔BMSCs,取第3代細(xì)胞用于實驗,分為PRF組和陽性對照組,誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后,對兩組細(xì)胞分別進行形態(tài)學(xué)觀察,成軟骨鑒定染色(番茄 O、甲苯胺藍、HE、Ⅱ型膠原免疫組化染色),軟骨相關(guān)基因表達檢測(SOX9、Ⅱ型膠原、Aggrecan、)。結(jié)果:PRF組和陽性對照組中BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后,細(xì)胞由長梭形變?yōu)槿切?、多角形、圓形;番茄O、甲苯胺藍、HE、Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性;SOX9、Ⅱ型

5、膠原、Aggrecan基因表達水平均較高,兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論:PRF在體外可促進兔BMSCs成軟骨分化,可作為自體生物材料,在構(gòu)建軟骨組織工程中發(fā)揮更好的作用。
　　第二部分:自體富血小板纖維蛋白修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的實驗研究
　　目的:探討自體富血小板纖維蛋白(PRF)體內(nèi)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的能力。方法:心臟采血制備PRF,將PRF膜片植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損,分別于術(shù)后12W、24W后處

6、死動物并收集標(biāo)本,進行大體觀察、生物力學(xué)性能分析、軟骨組織學(xué)和組織免疫化學(xué)染色、生物化學(xué)成分分析,驗證PRF膜片對關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的修復(fù)效果。結(jié)果:大體觀察PRF組新生軟骨表面光滑,修復(fù)良好。PRF組新生軟骨的大體形態(tài)評分結(jié)果、生物力學(xué)指標(biāo)、Ⅱ型膠原及其mRNA的表達均顯著優(yōu)于空白組(P<0.05),術(shù)后24W與正常軟骨相比,未見顯著差異(P>0.05)。組織學(xué)染色可見新生軟骨在各時間點,行番紅O、甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組化染色均出現(xiàn)陽

7、性表達,其結(jié)構(gòu)形態(tài)與周圍正常軟骨十分相近。結(jié)論:PRF膜片能夠有效修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨全層缺損,具有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　小結(jié):本實驗采用Choukroun方法利用自體血液快速離心制備PRF,體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs21d后,結(jié)果充分證實了PRF作為一種自體來源的生物支架材料,其緩慢釋放高濃度、符合人體生理比例的各種生長因子,可以體外誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞;將PRF膜片植入兔關(guān)節(jié)軟骨全層缺損處,行組織學(xué)、生物化學(xué)及生物力學(xué)測試,