miR-183靶向調控MTA1基因對骨肉瘤細胞增殖及遷移的影響.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤（osteosarcoma）是一種侵襲性的惡性腫瘤，從間質細胞系發(fā)展而來，具有成骨細胞分化的特點，且極易發(fā)生肺轉移，同時它也是兒童癌癥中生存率較低的腫瘤之一，患者的五年生存率僅為65％-70%，嚴重威脅著青少年的健康。近年來在基因分子的水平對疾病進行研究越來越受關注，因此從基因分子水平上研究骨肉瘤的發(fā)病機制及防治，對其未來的診斷和治療有更積極的作用。
　　腫瘤轉移相關基因（metastasis asso

2、ciatedgene1，MTA1）是核小體重塑和組蛋白去乙酰化酶復合物(Nucleosome remodeling and histonedeacetylase，NuRD)的重要組成部分。大量的研究發(fā)現 MTA1在多種腫瘤中高表達，并促進腫瘤的惡化，參與腫瘤的增殖、侵襲、遷移、凋亡和細胞周期等過程。有研究報道m(xù)iR-183在骨肉瘤細胞系MG63、U2-OS、Saos-2和HOS中均異常低表達，并能靶向埃茲基因（Ezrin，其蛋白又稱細胞

3、骨架結合蛋白）抑制MG63細胞的侵襲和遷移，多種生物信息學軟件預測顯示miR-183可能與MTA1存在靶向結合區(qū)。因此，探討miR-183靶向調控MTA1基因，對骨肉瘤增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響，將為骨肉瘤發(fā)病機制研究及臨床防治提供新的思路和方向。miR-183靶向調控MTA1基因對骨肉瘤細胞的影響及其分子作用機制的研究尚未見報道。
　　研究目的：
　　本研究將通過實驗驗證 MTA1是 miR-183的直接靶基因，轉染 m

4、iR-183 mimic至骨肉瘤細胞系 MG63，觀察miR-183對 MTA1的靶向調控作用，及對MG63細胞增殖、侵襲、遷移與凋亡的影響，由此尋找骨肉瘤研究及防治新的靶點和策略。
　　研究方法：
　　1.收集標本：自2014年9月至2016年6月從鄭州大學第一附屬醫(yī)院收集了25例骨肉瘤患者的癌組織及與其配對的癌旁組織，并置于-80℃冰箱中長期保存。采用實時熒光定量PCR技術檢測已收集標本中miR-183及MTA1基因的m

5、RNA表達水平，并通過免疫印跡Western blot檢測MTA1蛋白的表達并分析結果。
　　2.采用 TargetScan和 miRanda等生物信息學軟件預測靶向 MTA1的microRNA。
　　3.構建含有MTA13’端非翻譯區(qū)域（3’UTR）的野生型和突變型載體，運用雙熒光素酶報告基因實驗驗證MTA1與miR-183的靶向作用。
　　4.RT-qPCR法檢測正常成骨細胞株 hFOB1.19與人骨肉瘤細胞系 M

6、G63中miR-183與MTA1基因的mRNA表達水平。
　　5.體外合成miR-183 mimic和miR-183 negative control，采用脂質體將其分別轉染到各組人骨肉瘤細胞系MG63中。實驗分為3組，miR-183 mimic組：轉染miR-183 mimic；NC組：轉染miR-183 negative control；Control組：僅加脂質體。
　　6.CCK-8實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63的增殖

7、情況。
　　7.細胞劃痕實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63遷移能力改變情況。
　　8.Transwell實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63侵襲能力改變的情況。
　　9.流式細胞術及TUNEL實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63凋亡的情況。
　　10.免疫印跡Western blot法檢測轉染后MTA1蛋白的表達。
　　實驗結果：
　　1.RT-qPCR檢測結果顯示，骨肉瘤組織中miR-183的表達量顯著低于其在癌旁組織中

8、的表達(P<0.01)，而MTA1基因的 mRNA在骨肉瘤中的表達量明顯高于其在癌旁組織中的表達(P<0.01)。Western blot的結果顯示，與癌旁組織比較， MTA1蛋白在癌組織中呈現高表達。
　　2.雙熒光素酶報告基因實驗證明miR-183與MTA1基因的3’ UTR區(qū)域結合，與生物信息學軟件預測結果一致，表明MTA1是miR-183的靶基因。
　　3.RT-qPCR結果顯示，在骨肉瘤細胞系 MG63中miR-1

9、83的表達顯著低于成骨細胞株hFOB1.19中的表達(P<0.01)，而MTA1基因的mRNA表達則明顯高于其在成骨細胞株hFOB1.19中的表達(P<0.01)。
　　4.轉染后，miR-183 mimic組的miR-183表達量明顯高于NC組與Control組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明miR-183 mimic轉染骨肉瘤細胞成功。
　　5.CCK-8結果顯示，與NC組和Control組比較，轉染miR-1

10、83 mimic組的骨肉瘤細胞在相同時間點的 OD490吸光值有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NC組與Control組比較則無顯著差異(P>0.05)。
　　6.劃痕實驗結果顯示，miR-183組細胞的遷移能力較NC組與Control組低，而NC組與Control組比較則遷移能力無明顯差異。
　　7.Transwell實驗結果表明，miR-183組的骨肉瘤MG63細胞穿過基底膜的細胞數明顯低于NC組與Cont

11、rol組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但NC組與Control組穿過基底膜的細胞數量無明顯差異(P>0.05)。
　　8.流式細胞術與TUNEL實驗結果顯示，與NC組和Control組比較，miR-183組的骨肉瘤 MG63細胞的凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NC組與Control組比較，MG63細胞的凋亡率無顯著差異(P>0.05)。
　　9.免疫印跡Western blot檢測結果顯示，轉

12、染miR-183mimic后，與NC組和Control組比較，MTA1蛋白表達下降，而NC組與Control組比較，MTA1表達無顯著差異。
　　結論：
　　1.骨肉瘤組織與細胞系MG63中miR-183低表達，MTA1高表達。
　　2.miR-183可以通過靶向作用MTA1基因的3’UTR區(qū)域降低其轉錄表達，并發(fā)揮調控作用。
　　3.過表達miR-183可能通過降低靶基因MTA1表達而有效抑制骨肉瘤細胞系MG6