沉默ZFX對人骨肉瘤細胞侵襲及遷移能力的影響.pdf

1、目的:
　　明確骨肉瘤細胞及組織中ZFX基因的高表達與腫瘤發(fā)生的相關性,構建ZFX基因siRNA慢病毒載體,并轉染骨肉瘤Saos-2、MG-63細胞,觀察轉染后骨肉瘤細胞的ZFX的表達水平。通過下調ZFX基因在骨肉瘤Saos2、MG-63細胞中的表達,觀察其對骨肉瘤Saos2、MG-63細胞侵襲及遷移能力的影響。闡明其在骨肉瘤中的功能作用。
　　方法:
　　選取四種骨肉瘤細胞株U2-OS,Saos-2,MG-63和SW

2、1353,及選取47例手術時病理檢查證實為骨肉瘤的組織標本,人腦膠質瘤U251細胞作為ZFX表達的陽性對照,通過Western blot檢測四種骨肉瘤細胞及47例骨肉瘤組織標本中的ZFX的表達水平。并分析ZFX表達與骨肉瘤發(fā)生的相關性。
　　根據文獻報道的ZFX基因shRNA序列進行合成,并構建ZFX-siRNA慢病毒載體,經DNA測序確認構建成功后轉染骨肉瘤Saos2、MG-63細胞。采用Real time-PCR檢測病毒轉染后

3、Saos-2及MG-63的ZFX表達水平。
　　最后采用Transwell實驗分別觀察轉染siRNA-ZFX慢病毒載體的Saos2、MG-63細胞(Lv-shZFX)、空白對照(Con)、轉染含無義序列的慢病毒載體(Lv-shCon)三組細胞的侵襲及遷移能力變化,其中轉染含無義序列的慢病毒載體(Lv-shCon)為陰性對照。細胞計數(shù)使用25μL流式細胞儀分析。運動實驗使用Transwell細胞運動試劑盒。
　　結果:

4、　　ZFX在四種骨肉瘤細胞系均有表達。與U2OS細胞株相比,三種細胞系(MG63, Saos2和SW1353)表達了高水平的ZFX。ZFX在51.1％(24/47)的骨肉瘤患者組織標本中高表達。而且,骨肉瘤組織中ZFX的高表達與轉移顯著相關(P<0.05)。
　　經DNA測序鑒定確認慢病毒載體構建成功后,分別轉染骨肉瘤細胞株Saos-2及MG-63,質粒攜帶有GFP綠色熒光蛋白基因,熒光顯微鏡下,轉染成功的細胞可見綠色熒光。鏡下觀

5、察可見GFP表達在超過90％的細胞中可被觀察到,證明細胞轉染成功。
　　通過Real-time PCR驗證ZFX基因沉默效率。結果顯示,siRNA-ZFX(Lv-shZFX)組細胞中ZFX基因在mRNA水平較CON及Lv-shCon組明顯下降(P<0.05)。而CON與Lv-shCon兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。證實了shRNA慢病毒對ZFX基因具有顯著的沉默效率。
　　Transwell侵襲試驗結果顯示siRN