鹽芥TsVP啟動子核心區(qū)域的鑒定及其上游調(diào)控蛋白的功能分析.pdf

1、對高等植物非生物脅迫應(yīng)答的分子機制的研究具有重要的意義。擬南芥是一種典型的甜土植物，它在耐鹽耐旱機制研究方面有其自身的局限性。鹽芥是擬南芥的近緣種，是一種高度耐鹽耐旱的鹽生植物，且具有基因組小，cDNA序列與擬南芥相似程度高等優(yōu)點，已成為人們研究植物非生物脅迫響應(yīng)的模式植物。
　　 基因表達調(diào)控發(fā)生在染色體、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后多個水平上，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控尤為重要。啟動子作為控制基因轉(zhuǎn)錄的順式作用因子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始，

2、在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且其調(diào)控作用的實施需要轉(zhuǎn)錄因子蛋白的參與。本研究以鹽芥液泡焦磷酸酶基因TsVP的啟動子為實驗材料，通過對該啟動子核心元件的鑒定及其上游結(jié)合蛋白的功能分析，揭示了TsVP基因?qū)}脅迫誘導響應(yīng)的部分機制。
　　 本實驗室高峰等發(fā)現(xiàn)，盡管在酵母和煙草中過表達TsVP和AVP1都可以提高宿主的耐鹽性，但它們在鹽脅迫條件下表達模式不同：TsVP的表達受鹽脅迫誘導，而AVP1則對鹽誘導不發(fā)生反應(yīng)。為了研究造成

3、這種差異的原因，本工作克隆出這兩個基因的啟動子區(qū)域并進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)二者在順式作用元件的種類，數(shù)量以及分布存在明顯的差異。
　　 為了較深入了解TsVP啟動子的結(jié)構(gòu)和特性，構(gòu)建了一系列的5’端缺失突變體，將它們分別與報告基因gus連接，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，全長TsVP啟動子(2200bp)在正常條件下高強度啟動報告基因的表達，其GUS表達強度與CaMV35S啟動子驅(qū)動的GUS表達強度差異不大；在鹽脅迫下，其

4、GUS表達活性在根部和葉中受到明顯的誘導作用，升高到未脅迫時的3倍左右。PT1(全長TsVP啟動子連接GUS報告基因)和PA1(全長AVP1啟動子連接GUS報告基因)在正常生長條件下具有相似的表達模式，幾乎在種子外的每一個組織中都具有活性。但在鹽脅迫處理后，PT1在根、葉中的表達受到明顯的誘導，在根部高強度表達主要出現(xiàn)在根尖處，而在PA1中未發(fā)現(xiàn)這種誘導現(xiàn)象。PT1啟動子的高驅(qū)動能力表明該啟動子在植物基因工程中有很好的應(yīng)用價值。在5’系

5、列缺失突變體中，PT2與PT1相比缺少了一段856bp的區(qū)域(-2200至-1344)，導致PT2的活性要明顯低于PT1的，推測在-2200到-1344這段區(qū)域存在著可以明顯提高啟動子活性的增強子元件。此外，PT2在花中表現(xiàn)出明顯的花藥特異性表達模式。這種表達模式同樣出現(xiàn)在缺失突變體PT3到PT6的轉(zhuǎn)基因植株中，但在PT7到PT9中消失。推測一個AAATGA元件可能在花的花藥特異表達模式中起關(guān)鍵作用。
　　 通過對系列缺失突變體

6、在正常條件以及鹽脅迫條件下的GUS基因表達分析，最終鑒定得到一段130bp(-667至-538)的核心序列。該序列對于TsVP啟動子的鹽脅迫誘導響應(yīng)具有重要的作用。農(nóng)桿菌介導的煙草葉片GUS瞬時表達分析也表明這130bp區(qū)域可以很好的響應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。在該區(qū)域尚未發(fā)現(xiàn)與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的已知作用元件，因此對該區(qū)域進行進一步分析，找到其中存在的核心序列，并找到調(diào)控該元件的功能蛋白，無疑具有重要的學術(shù)意義。以這段核心序列為誘餌，通過酵母單雜交系

7、統(tǒng)篩選得到了與之相互作用的兩個蛋白，命名為TsNac1和TsVOZ1。
　　 TsNac1的ORF全長918bp，與擬南芥RD26(AT4G27410)具有86％的核苷酸相似性，92％的氨基酸相似性。RT-PCR檢測表明，TsNac1基因在正常生長條件下的表達量在根中遠小于葉中的，但在鹽脅迫、干旱脅迫和ABA處理后，根中表達量的變化幅度高于葉中的。TsNac1基因的表達受鹽脅迫、干旱脅迫和ABA脅迫的誘導。在這三種脅迫條件下該基

8、因表達強度的變化幅度有不同，對ABA誘導的響應(yīng)最明顯，尤其是在根中，處理12小時后其表達量上升了1000多倍。在鹽脅迫條件下TsNac1基因的表達水平可上調(diào)60多倍，而對干旱誘導的響應(yīng)相對較弱，尤其在葉中。這些結(jié)果表明該基因有可能是鹽芥耐鹽機制的重要成員，與ABA信號傳導有重要聯(lián)系。構(gòu)建TsNac1原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導轉(zhuǎn)化菌表達重組蛋白。利用已獲得的TsNac1重組蛋白，與上述130bp的啟動子序列進行體外結(jié)合試驗。

9、EMSA試驗的結(jié)果表明，TsNac1蛋白可以很好的與該片段在體外結(jié)合，而且這種結(jié)合具有良好的特異性。鑒于TsNac1與TsVP啟動子中的鹽誘導響應(yīng)區(qū)域特異性結(jié)合，而且其本身的表達受到鹽、干旱以及ABA的誘導，推測TsNac1很可能就是我們要尋找的調(diào)控TsVP表達的上游轉(zhuǎn)錄因子，對其進行深入研究以揭示TsNac1的生物學功能以及其調(diào)控的下游基因網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義。
　　 通過在擬南芥中過表達和抑制表達TsNac1，初步分析了該基因

10、在植物耐鹽性方面的作用。TsNac1基因的過表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，而抑制該基因則明顯增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽敏感性。
　　 鑒定TsNac1在TsVP啟動子上的結(jié)合位點可以為了解其作用機制提供有價值的參考資料，也可以為植物基因工程改良提供具有使用價值的啟動子元件，因此鑒定TsNac1在TsVP啟動子上的靶位點具有重要的意義。利用不同的過量非標記競爭性DNA來競爭標記DNA與TsNac1蛋白的結(jié)合，鑒定出一段20bp的DN

11、A序列(GAATATACCATGGATAAGCA)為該蛋白的結(jié)合位點。在這段DNA序列中包含CATG元件。目前認為NAC家族蛋白的結(jié)合位點為CACG，但是Trans等研究表明擬南芥中NAC家族的蛋白也可結(jié)合一段MYC-like CATGTG位點。推測CATG可能是TsNac1蛋白結(jié)合的核心位點，其結(jié)合也需要周圍的幾個甚至十幾個核苷酸序列。
　　 利用CHIP-on-chip技術(shù)對該蛋白在擬南芥染色體中的結(jié)合位點進行了詳細的分析，

12、并利用RT-PCR對實驗結(jié)果進行了驗證。結(jié)果表明在擬南芥中該蛋白與284個基因的啟動子區(qū)域有結(jié)合作用，這284個基因參與了眾多的生物學過程，包括了代謝，發(fā)育，細胞定位，刺激響應(yīng)，生殖，蛋白磷酸化，氧化還原等生物學過程。值得注意的是在這284個基因中，有大約70個屬于轉(zhuǎn)錄因子類基因，占25％左右，而擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子只占全部基因數(shù)量的5％左右。也就是說在TsNac1的靶基因中，轉(zhuǎn)錄因子所占的比例大概是正常比例的5倍，而且其靶基因中包括了像D

13、REB這種公認的與植物抗逆有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，這也表明在TsNac1基因在植物抗逆中的重要調(diào)控作用。此外該基因還可以通過調(diào)節(jié)一些小分子轉(zhuǎn)運體基因，結(jié)構(gòu)基因以及一些結(jié)合蛋白基因的表達來調(diào)控下游功能基因的表達，而且該基因也可以直接調(diào)控一些功能基因的表達水平。這些結(jié)果表明TsNac1在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中應(yīng)該處于一個較為上游的位置。此外，TsVP在擬南芥中的同源基因AVP1并不在這些靶基因中，通過前面啟動子分析的工作知道AVP1雖然屬于抗逆相關(guān)基因，但

14、是其本身的表達并不受鹽脅迫的誘導，這一結(jié)果表明TsNac1并沒有參與AVP1基因的調(diào)控，這與預期是相符合的。另外，利用酵母單雜交系統(tǒng)還鑒定出與基于TsVP啟動子構(gòu)建的誘餌相結(jié)合的TsVOZ1蛋白。該蛋白與擬南芥中的AVOZ1具有85％的核苷酸相似性，90％的氨基酸相似性，其表達受鹽脅迫的誘導，但是卻不受干旱以及ABA的誘導，而且其受鹽脅迫響應(yīng)的程度遠不如TsNac1明顯。根據(jù)Mitsuda N等人對AVOZ1的研究結(jié)果，在TsVP啟動子

15、區(qū)域中，找到了一段GCGTNx7ACGC回文序列，即GCGTCGGCTGCACGC(-274到-259)，但是這段序列并不在上述鑒定得到的130bp核心序列中。通過在擬南芥中對TsVOZ1基因進行過表達和抑制表達，得出TsVOZ1的過表達以及基因敲除并沒有明顯影響轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。TsVOZ1雖然與該啟動子有結(jié)合，然而并沒有參與該基因鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控。
　　 這些工作通過對鹽芥中TsVP啟動子及其上游調(diào)控蛋白的功能分析，不僅