過表達Beclin 1誘導的自噬提高了MG63對Gemcitabine的抵抗與Wnt信號通路關系的研究.pdf

1、目的：
　　Wnt/β-catenin信號傳導通路異常與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，但Wnt/β-catenin信號傳導通路在抗腫瘤化療藥物抵抗方面的作用機制仍不清楚。通過研究 Beclin1基因過表達在 MG63骨肉瘤細胞自噬以及 MG63骨肉瘤細胞對Gemcitabine的抵抗中的作用，和Wnt/β-catenin信號傳導通路在MG63骨肉瘤細胞自噬中的作用，探討Wnt/β-catenin信號傳導通路與Beclin1基因過表達M

2、G63骨肉瘤細胞對Gemcitabine的抵抗之間的關系。
　　方法：
　　1.MG63骨肉瘤細胞培養(yǎng)
　　用DMEM培養(yǎng)液加上10%滅活的胎牛血清,在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MG63骨肉瘤細胞，待細胞約90%融合時，在生物安全柜中進行細胞傳代。加入少許0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA，消化3-5分鐘，倒置顯微鏡下觀察到胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時，完全培養(yǎng)基終止消化，離心去上清（1000 rpm），按1

3、:3比例進行細胞傳代。
　　2.共焦熒光顯微鏡監(jiān)測自噬
　　將DsRed-LC3-GFP連接到逆轉錄病毒載體上，與輔助質(zhì)粒Gag-pol和VSVG一起共轉染293T細胞，收集病毒上清后感染靶細胞。經(jīng)Puromycin篩選后，建立穩(wěn)定表達DsRed-LC3-GFP的細胞株。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞3天做為陽性對照組觀察自噬的發(fā)生。在共焦熒光顯微鏡下觀察靶細胞熒光表達情況，沒有發(fā)生自噬時，DsRED紅光和GFP綠光都有表達

4、，發(fā)生自噬時，主要表現(xiàn)為DsRED紅光為主。
　　3.Western blot檢測
　　在細胞蛋白抽提開始前加入0.1mol/L PMSF，1×106細胞用PBS洗兩次，用含有0.1mol/L PMSF的裂解液孵育。細胞裂解物13000rpm，4℃離心20min。梯度稀釋BSA標準品，配制濃度為20-2000μg/mL的待測樣品。配制 BCA溶液，顯色反應30min，562nm測定標準液和樣品的吸光度，平行測三次，計算待測樣

5、品濃度。根據(jù)待檢測蛋白的分子量，配制10%的分離膠，濃縮膠濃度為4%。取待檢測蛋白樣品20μL上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉0.45μm孔徑NC膜1小時，將膜完全浸沒在5%脫脂奶粉-TBST中室溫輕搖1小時，一抗（anti-Beclin1和anti-LC3B）室溫孵育10min，放4℃過夜，第二天取膜，在室溫孵育30min，TBST洗膜5次，3min/次，用HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L），室溫下輕搖40min，TBST洗

6、膜6次，3min/次。配制ECL溶液，將其滴加到膜上，室溫下避光反應3-5min，選擇不等時間多次膠片曝光，顯影1-2min，定影。
　　4.PCR檢測Caspase3、Caspase7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表達
　　取貼壁培養(yǎng)的呈對數(shù)生長的MG63骨肉瘤細胞約0.5×106個，培養(yǎng)12小時后分別給予Gem（10μg/mL）、Gem（50μg/mL）、Beclin1+Gem（10μg/mL）、Bec

7、lin1+Gem（50μg/mL）處理，并設立空白對照組。培養(yǎng)24小時后，用0.125%的胰蛋白酶消化后，PBS洗滌2次，用TRIZOL試劑提取細胞總RNA，根據(jù)操作說明合成cDNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書進行總RNA逆轉錄。
　　5.PCR檢測ATG4、Beclin1、LAMP1、ATG5、ATG12的表達
　　選取對數(shù)生長期的 MG63骨肉瘤細胞約0.5×106個，培養(yǎng)12小時后分別給予Wnt3a(

8、200ng/mL)、XAV939（1μmol/L）處理，設對照組。依次進行細胞總RNA的提取、cDNA的合成、總RNA逆轉錄以及檢測基因引物探針的設計（方法同4）。
　　6.流式細胞儀檢測
　　將MG63骨肉瘤細胞以1×106接種于6孔板，培養(yǎng)72小時后進行消化，使細胞形成單細胞懸液，2000rpm離心5min，棄去上清，用預冷的PBS洗滌2次。用100μL結合緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin-V染色液和5μL P

9、I染色液，室溫下避光孵育20分鐘，以流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　7.ELISA技術分析beclin1在MG63骨肉瘤細胞上清的水平
　　取10μL細胞上清液用0.05mol/L NaHCO3稀釋到100μL包被ELISA板，室溫下振蕩1.5小時。PBST洗板3次，加封閉液（PBST加1％脫脂奶粉）350μL/孔，室溫下放置1小時，PBST洗3次。加封閉液稀釋的胃蛋白酶原一抗100μL/孔，ELISA板于室溫振蕩1小時，PB

10、ST洗3次。加封閉液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗100μL/孔，ELISA板于室溫振蕩1小時，PBST洗3次。加入OPD顯色液100μL/孔，避光反應約10-30分鐘。1mol/L H2SO4100μL/孔終止反應，酶標儀測OD450nm。
　　實驗結果以均數(shù)±標準差表示，組間整體比較采用單因素/雙因素方差分析，進一步采用LSD法進行兩兩比較檢驗。所有分析均在SPSS16.0軟件中完成，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

11、　　結果：
　　1.過表達Beclin1基因可誘發(fā)MG63骨肉瘤細胞自噬的發(fā)生
　　過表達Beclin1基因的MG63骨肉瘤細胞蛋白條帶明顯，而對照組細胞未見明顯蛋白條帶，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明在 MG63骨肉瘤細胞中成功的過表達了Beclin1基因。過表達Beclin1基因的MG63骨肉瘤細胞其LC3B-Ⅱ蛋白條帶較對照組明顯，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明 LC3B發(fā)生剪切，即自噬增加

12、。
　　2.Beclin1過表達后可減少Gemcitabine誘導的MG63骨肉瘤細胞凋亡
　　Gemcitabine可誘導凋亡相關基因（Caspase3、Caspase7）的表達，下調(diào)抗凋亡基因（BCL-2，cyclin D1和c-FLIP）的表達，且呈劑量依賴性。Beclin1基因過表達后會逆轉上述過程，減少凋亡相關基因的表達。
　　3.激活Wnt信號通路可降低MG63骨肉瘤細胞自噬，抑制可促進自噬
　　激活

13、 Wnt信號通路可降低自噬,抑制 Wnt信號通路可促進自噬。抑制Wnt/β-catenin信號通路可顯著增加Beclin1基因的表達，表明Beclin1基因的表達可能在Wnt/β-catenin信號通路抑制自噬方面起一定的作用。
　　4.激活Wnt信號通路可降低自噬，減少Beclin1基因過表達MG63骨肉瘤細胞對Gemcitabine的抵抗
　　Gemcitabine可以誘導MG63骨肉瘤細胞凋亡，Beclin1基因過表達

14、MG63骨肉瘤細胞可減少Gemcitabine誘導的凋亡，激活Wnt信號通路可降低自噬，增加Beclin1基因過表達MG63骨肉瘤細胞凋亡，從而減少Beclin1基因過表達骨肉瘤細胞對Gemcitabine的抵抗。應用Gemcitabine處理的Beclin1基因過表達MG63骨肉瘤細胞存活率呈劑量依賴性下降，在應用 Gem（40μg/mL）和 Gem（60μg/mL）處理的Beclin1基因過表達MG63骨肉瘤細胞中加用Wnt3a（2

15、00ng/mL）可明顯降低細胞存活率，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而加用 XAV939（1μmol/L）可明顯提升細胞存活率，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。實驗結果表明，Wnt信號傳導通路通過下調(diào) Beclin1基因的表達抑制 MG63骨肉瘤細胞的自噬，降低Gemcitabine誘導的MG63骨肉瘤細胞凋亡。
　　結論：
　　Beclin1基因過表達可誘發(fā)MG63骨肉瘤細胞自噬的發(fā)生，并減少Gemcit

16、abine誘導的MG63骨肉瘤細胞凋亡。Beclin1過表達后可減少Gemcitabine誘導的凋亡，但Wnt信號通路激活可反向抑制。我們的研究結果為解決抗腫瘤化療藥物耐藥性的問題提供了一個新的見解。Wnt/β-catenin信號通路異常可以促進Beclin1介導自噬，從而阻止化療藥物誘導的細胞凋亡。我們的研究結果為通過調(diào)節(jié)異常 Wnt/β-catenin信號通路相關自噬和自噬基因Beclin1，提高化療藥物對腫瘤細胞凋亡的敏感性提供了