靶向抑制自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1對HCMV潛伏感染的影響.pdf

1、目的:人巨細胞病毒(HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，人群普遍易感，在成年人中的感染率高達90％，而我國孕婦的感染率更高，達95％以上。雖然HCMV原發(fā)性感染在個體免疫功能健全時并不引起臨床癥狀，但初次感染后可在體內(nèi)建立潛伏感染，待宿主免疫功能受限時，可導致嚴重的臨床后果，如肝炎，腦炎乃至死亡。更為重要的是，在先天性感染中，大約10％～15％被感染的新生兒有臨床癥狀，表現(xiàn)為黃疸型肝炎、肝脾腫大、肺炎等嚴重的臨床后果。而在無癥狀的患兒中，10

2、％～17％會發(fā)展為耳聾或者神經(jīng)發(fā)育異常。自噬(autophagy)是一種由溶酶體介導將體內(nèi)衰老的細胞器或者錯誤折疊的蛋白降解成小分子氨基酸的降解通路。它不僅可以抵御病原體的侵襲，還通過為細胞提供能源來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來，關(guān)于HCMV與自噬的關(guān)系的研究也日趨增多，并取得了階段性的進展。但這些研究都是在HCMV增殖感染模型上進行的，目前有關(guān)自噬水平變化與HCMV潛伏感染的關(guān)系尚無文獻報道。明確自噬水平變化對HCMV潛伏感染的影響，

3、有助于了解HCMV潛伏感染的機制，并為臨床HCMV的預防與治療提供新的思路。
　　方法:本研究包括兩部分內(nèi)容:
　　(1)建立HCMV潛伏感染模型:用HCMV Towne株感染人急性單核白血病細胞（human acute monocytic leukaemia cell line，THP-1）作為實驗組，以未感染的THP-1細胞作為空白對照組，在感染后1d、3d、5d、7d、9d時，去除培養(yǎng)液，并收集細胞。提取細胞內(nèi)的DNA

4、，熒光定量檢測THP-1細胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);Trizol法提取細胞總RNA后，RT-PCR檢測HCMV UL122、UL123和UL138基因的表達水平;RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白后，western blot檢測HCMV IE蛋白和UL138蛋白表達水平。確定是否建立了HCMV潛伏感染模型。
　　(2)靶向抑制自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1對HCMV潛伏感染的影響:構(gòu)建Beclin1的干擾慢病毒載體，并篩選出有效

5、的干擾慢病毒載體及作用濃度。以HCMV Towne株感染THP-1細胞作為陰性對照組，以HCMV Towne株+空白載體轉(zhuǎn)染THP-1細胞作為空白對照組，以HCMV Towne株+Beclin1干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細胞作為實驗組，并從透射電鏡觀察自噬體數(shù)量的變化、RT-PCR檢測Beclin1、Atg5、Atg7、LC3、UL122、UL123、UL138 mRNA水平，以及western blot檢測Beclin1、Atg5、

6、Atg7、LC3、IE、UL138蛋白水平這三個方面了解Beclin1干擾慢病毒載體是否引起細胞自噬水平的變化以及自噬水平變化后對HCMV潛伏感染狀態(tài)的影響。
　　結(jié)果:成功建立了HCMV潛伏感染的模型。熒光定量PCR來檢測HCMV DNA的拷貝數(shù)，其結(jié)果表明:HCMV Towne株感染THP-1細胞1d、3d、5d，HCMV DNA拷貝數(shù)逐漸增加，感染5d、7d、9d，DNA拷貝數(shù)逐漸減少;RT-PCR的結(jié)果顯示:HCMVTow

7、ne株感染THP-1細胞后，在感染早期有HCMV即刻早期IE基因(UL122、UL123)的表達，UL122基因mRNA水平在感染后的1d、3d均有表達，5d后基本不表達;UL123基因mRNA表達水平則不明顯;在感染早期，潛伏相關(guān)基因UL138 mRNA的表達水平則不明顯;隨著感染時間的延長，HCMV UL138基因逐漸表達增加。Western blot的結(jié)果表明:HCMV Towne株感染THP-1細胞后，IE蛋白在感染后1d、3d

8、有表達，而感染5d后未檢測到IE蛋白的表達，但UL138蛋白則持續(xù)表達。
　　透射電鏡結(jié)果顯示:在非連續(xù)區(qū)域，隨機選取5個細胞，正常THP-1細胞組平均每個細胞自噬體的數(shù)量為3個，不轉(zhuǎn)染慢病毒載體組10個，轉(zhuǎn)染GV248空白載體組9個，轉(zhuǎn)染GV248-Beclin1-9244組6個;Beclin1干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，與正常THP-1細胞相比，自噬體數(shù)量是增加的;但與不轉(zhuǎn)染慢病毒載體組以及轉(zhuǎn)染GV248空白載體組相比，自噬小體數(shù)量

9、是減少的，因此，轉(zhuǎn)染Beclin1干擾慢病毒載體后自噬體數(shù)量有所減少。與陰性對照組組及空白對照組相比，實驗組的自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平明顯減少，而與病毒復制和潛伏相關(guān)基因UL122和UL138的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平并無明顯變化。熒光定量PCR檢測HCMV DNA拷貝數(shù)結(jié)果顯示:與陰性對照組及空白對照組相比，在未建立潛伏感染時，實驗組的HCMV DNA拷貝數(shù)在第5d時下降較明顯，而在潛伏感染