小檗堿通過(guò)作用于Beclin1基因抑制脂肪細(xì)胞自噬.pdf

1、脂肪分解和自噬在能量供應(yīng)過(guò)程中起著相似的作用，在飽食狀態(tài)，自噬和脂解都是被抑制的，細(xì)胞存儲(chǔ)脂質(zhì)；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)受限時(shí)，自噬增加，同時(shí)伴隨TG合成被抑制，脂解增加。這些相似性和同步化提示脂質(zhì)的分解和自噬途徑之間可能存在尚未被闡明的密切關(guān)系，脂肪細(xì)胞可能存在與其他細(xì)胞機(jī)制完全不同的自噬調(diào)控及信號(hào)傳遞途徑。以自噬為靶點(diǎn)的藥物研究可能在脂肪細(xì)胞相關(guān)疾?。ǚ逝帧⒁葝u素抵抗及2型糖尿病等）的治療中具有潛在的應(yīng)用前景。
　　 目的：觀察小檗堿對(duì)誘導(dǎo)分

2、化的3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬的影響；探討小檗堿通過(guò)作用于AMPK通路及Beclin1基因抑制脂肪細(xì)胞自噬及在高脂飼養(yǎng)大鼠模型上加以驗(yàn)證。
　　 方法：培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞至不同誘導(dǎo)分化時(shí)期，小檗堿進(jìn)行藥物干預(yù)。采用透射電鏡觀察自噬體；轉(zhuǎn)染LC3-GFP-LENTIVIRAL質(zhì)粒系統(tǒng)，在293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒擴(kuò)增，收集病毒上清感染3T3-L1靶細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察自噬體點(diǎn)狀聚集；Real-time PCR及Northern

3、Blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因變化；蛋白免疫印跡分析檢測(cè)特異性標(biāo)記自噬相關(guān)抗體的變化；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Beclin1基因3’UTR對(duì)mRNA穩(wěn)定性的作用及Promoter對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響；突變Beclin1基因3’UTR AU富集區(qū)進(jìn)行驗(yàn)證；siRNA干擾AMPK；高脂飼養(yǎng)大鼠模型觀察小檗堿抑制脂肪細(xì)胞自噬。
　　 結(jié)果：小檗堿進(jìn)行處理后。透射電鏡下觀察到自噬體數(shù)量減少；營(yíng)養(yǎng)剝奪狀態(tài)，熒光顯微鏡下見(jiàn)到自噬體點(diǎn)狀聚集；
　　

4、Real-time PCR及Northern Blot顯示Beclin1基因表達(dá)受抑制；蛋白免疫印跡LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)減少；報(bào)告基因Beclin1 3’UTR熒光素酶活性表達(dá)呈劑量依賴性抑制、Promoter沒(méi)有明顯變化；加入各通路激動(dòng)劑/抑制劑及siRNA干擾AMPK，顯示小檗堿抑制脂肪細(xì)胞自噬與AMPK通路相關(guān)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示小檗堿可以部分逆轉(zhuǎn)高脂引起的自噬增加。
　　 結(jié)論：小檗堿抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞自噬