YAP1促進人肺腺癌細胞厄洛替尼耐藥的作用及其機制探討.pdf

1、目的:
　　截止目前，肺癌已經(jīng)成為人類癌癥死亡的主要原因。我國的肺癌發(fā)病率與死亡率居高不下，其占男性肺癌發(fā)病率的第一位，在女性中也僅次于乳腺癌。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，約占全部肺癌病理類型的85％。隨著基因水平和腫瘤分子生物學研究的深入，針對于肺癌驅(qū)動基因的分子靶向治療已取得重大突破。其中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal gro

2、wthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)代表性藥物厄洛替尼(erlotinib，ER)和吉非替尼(gefitinib)已成為EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者的標準一線治療方案，其中位無進展生存期(progress-free survival，PFS)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的放療與化療。遺憾的是，患者在TKIs治療后的6到12個月均不可避免地發(fā)生耐藥。NSCLC的EGFR

3、-TKIs耐藥機制已成為目前研究的熱點。
　　Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信號通路中最核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控共激活因子，定位于人類染色體11q22，共有兩種結(jié)構(gòu)亞型:YAP1和YAP2，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進而調(diào)控下游靶基因的表達。隨著研究的深入，YAP基因在耐藥中的作用越來越受到重視。相關(guān)研究表明，YAP1基因的表達在NSCLC中上調(diào)，且在肺腺癌中尤為顯著;同時YAP1在耐西妥昔單抗的

4、NSCLC細胞中也表達增高。AXL是率先在白血病細胞分離出來的癌基因，屬于受體酪氨酸激酶家族（RTKs）成員之一，可以通過結(jié)合配體生長阻滯特異基因6(growth arrest-specific，GAS6)激活下游信號通路。有研究表明AXL的過度激活參與了EGFR-TKIs耐藥，與此同時YAP1通過調(diào)控AXL也參與了肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但在NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥中，YAP1是否通過調(diào)控AXL起作用，我們尚未見報道

5、。
　　本實驗擬采用PC-9敏感細胞和前期誘導(dǎo)建立的耐厄洛替尼PC-9(PC-9/ER)細胞為研究對象，對YAP1和相關(guān)靶基因在人肺腺癌厄洛替尼耐藥中的作用和相關(guān)機制進行探討，期望為認識NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥的機制提供新的思路，為克服此種耐藥提供一個有效靶點。
　　方法:
　　1、觀察PC-9敏感細胞和前期誘導(dǎo)建立的PC-9/ER細胞的形態(tài)學改變，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)

6、法檢測PC-9/ER的耐藥性。
　　2、在PC-9敏感細胞和PC-9/ER細胞中，利用qRT-PCR、Western blot和間接免疫熒光方法，檢測YAP1、AXL和p-AKT的表達變化。
　　3、以PC-9/ER細胞為研究對象，構(gòu)建慢病毒載體shRNA-YAP1轉(zhuǎn)染細胞。qRT-PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后YAP1及AXL的表達。Western blot檢測YAP1及下游AXL、p-AKT的表達變化;利用CCK-8法檢測干擾Y

7、AP1基因后對PC-9/ER細胞耐藥性的影響。
　　4、在PC-9細胞中過表達AXL基因，在PC-9/ER細胞中同時干擾YAP1和過表達AXL基因;Western blot檢測YAP1及下游AXL、p-AKT的表達變化;利用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染前后PC-9、PC-9/ER細胞耐藥性的變化。
　　結(jié)果:
　　1、課題組前期通過大劑量沖擊(1-5μM)和低劑量誘導(dǎo)成功建立PC-9/ER細胞，CCK-8法檢測IC50值和耐藥

8、指數(shù)。PC-9細胞和PC-9/ER細胞的IC50值分別為(0.10±0.02)μM和(8.68±1.17)μM，PC-9/ER細胞耐藥指數(shù)為90.92±14.06。與親代PC-9細胞相比較，YAP1、AXL和p-AK在PC-9/ER細胞中mRNA和蛋白水平均有明顯升高(P＜0.05)。
　　2、構(gòu)建慢病毒干擾載體LV-YAP1-RNAi，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC-9/ER細胞，干擾效率達52％左右。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi的PC-9/

9、ER細胞中YAP1、AXL和p-AKT蛋白表達水平較對照組均明顯降低(P＜0.05);而IC50值由未轉(zhuǎn)染細胞的(8.57-±-0.65)μM降低為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi PC-9/ER細胞的(1.28±-0.16)μM(P＜0.05)，耐藥指數(shù)約降為原來的1/7。
　　3、通過慢病毒轉(zhuǎn)染在PC-9細胞中過表達AXL基因，AXL mRNA表達水平升高34倍。相應(yīng)的AXL和p-AKT蛋白表達水平較對照組明顯升高(P＜0.0

10、5)。PC-9細胞的IC50值由轉(zhuǎn)染前的(0.11±0.02)μM升高到轉(zhuǎn)染后的(1.41±0.36)μM(P＜0.05)。
　　4、通過慢病毒轉(zhuǎn)染在PC-9/ER細胞中同時敲低YAP1和過表達AXL基因，AXL mRNA表達水平與只敲低YAP1對照組相比升高2.6倍。相應(yīng)的AXL和p-AKT蛋白表達水平較只敲低YAP1對照組升高(P＜0.05)。PC-9/ER細胞的IC50值由單獨轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi的(1.23±0.1

11、5)μM升高到共轉(zhuǎn)染LV-YAP1-RNAi和LV-AXL的(2.90-±-0.27)μM（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、YAP1基因的表達上調(diào)在人肺腺癌細胞厄洛替尼耐藥中起一定作用，且該調(diào)控作用可能與激活下游的AXL酪氨酸激酶和p-AKT有關(guān)。
　　2、抑制YAP1基因表達可以部分恢復(fù)PC-9/ER細胞對厄洛替尼的敏感性，同時下調(diào)了下游靶蛋白AXL和p-AKT的表達。
　　3、過表達AXL基因可以增強P