IGF-1R在非小細胞肺癌厄洛替尼耐藥中的作用及其調控機制.pdf

1、我國是肺癌發(fā)生率和死亡率最高的國家之一。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占3/4，是主要病理類型。近年來，隨著基礎研究和臨床隨機對照研究的不斷深入，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)已經(jīng)成為NSCLC的重要靶點。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的出現(xiàn)和應用不僅為NS

2、CLC患者帶來了更長的生存時間，同時也大大提高了患者的生存質量。然而，隨之而來的EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥這一棘手問題也困擾著廣大臨床工作者。其機制目前已較明確的有c-met擴增、T790M突變和原突變外顯子二次突變等，而IGF-1R的擴增在NSCLC耐藥中的作用，近來也越來越受到關注。IGF-1R擴增機制如何？有何調控因素等問題至今仍未得到充分解釋。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來研究較廣泛和深入的一類小的非編

3、碼RNA，它參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移及耐藥等多步驟多過程，在多種類型腫瘤發(fā)病中分別發(fā)揮促癌或抑癌的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC中miR-223表達降低;應用生物信息學及雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1受體(Insulin like growth factor1receptor，IGF-1R)是miR-223的靶基因之一。既然在NSCLC EGFR-TKIs治療耐藥中有IGF-1R擴增機制參與，那么可以推測，miR-

4、223可能通過調控IGF-1R信號通路而在NSCLCEGFR-TKIs治療耐藥中發(fā)揮重要作用?；谝陨显O想，本實驗采用課題組前期誘導的耐厄洛替尼PC-9細胞（PC-9/ER細胞）及其親本PC-9肺腺癌細胞為研究對象，探討IGF-1R在NSCLC EGFR-TKIs靶向治療耐藥中的作用及其調控機制。
　　目的:
　　在細胞水平及裸鼠移植瘤模型中研究IGF-1R在NSCLC細胞EGFR-TKIs耐藥的機制，以及miR-223在這

5、一過程中的調控作用。
　　方法:
　　1.穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代PC-9/ER細胞，并與親本PC-9肺腺癌細胞比較，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測PC-9/ER的耐藥性。
　　2.應用慢病毒轉染法構建miR-223過表達PC-9/ER細胞(PC-9/ER-miR-223)及對照空載體PC-9/ER細胞(PC-9/ER-EV)。
　　3.應用流式細胞術根據(jù)GFP熒光純化轉染細胞。
　

6、　4.應用流式細胞術檢測PC-9/ER-miR-223細胞及PC-9/ER-EV細胞在1μM厄洛替尼作用48h后的凋亡率。
　　5.檢測PC-9細胞、PC-9/ER細胞、PC-9/ER-miR-223細胞及PC-9/ER-EV細胞中IGF-1R的mRNA及蛋白表達水平。
　　6.利用IGF-1激動IGF-1R表達，觀察其最佳激動作用的濃度及時間。
　　7.Western blot方法檢測PC-9細胞、PC-9/ER細胞

7、、PC-9/ER-miR-223細胞及PC-9/ER-EV細胞中IGF-1R/AKT/S6信號通路表達水平。
　　8.構建裸鼠成瘤模型，觀察各組裸鼠移植瘤體積大小及生存情況。
　　結果:
　　1.穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代PC-9細胞系。
　　2.成功構建慢病毒過表達miR-223過表達載體，穩(wěn)定轉染PC-9/ER細胞。
　　3.應用流式細胞術成功分選出攜帶GFP熒光的PC-9/ER-miR-223細胞及PC-9/ER

8、-EV細胞，陽性率分別為95.6％和97％，熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長情況，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)方圓，成簇生長，呈綠色熒光。
　　4.qRT-PCR方法檢測PC-9/ER細胞轉染miR-223前后mRNA水平表達差異，結果顯示轉染組較對照組升高約16倍(p＜0.05)。
　　5.流式細胞術檢測PC-9/ER-miR-223組細胞凋亡率（18.92±2.123）是PC-9/ER-EV組（11.13±1.127％）的1.7倍(p＜0.0

9、5)。
　　6.CCK-8法檢測PC-9、PC-9/ER、PC-9/ER-miR-223、PC-9/ER-EV組細胞的IC50分別為0.25，5.16，1.19和5.29μM(p＜0.05)。
　　7.PC-9/ER細胞中IGF-1R mRNA水平是其親本細胞PC-9的2.85倍(p＜0.05)，蛋白水平是PC-9的1.75倍(p＜0.05)。
　　8.PC-9/ER-miR-223細胞中IGF-1R mRNA水平較其

10、對照組PC-9/ER-EV細胞降低了43％(p＜0.05)，蛋白水平較對照組降低了34％(p＜0.05)。
　　9.IGF-1R及其下游分子AKT、S6在PC-9/ER中過表達，而過表達的miR-223可靶向抑制IGF-1R/AKT/S6信號通路，且其抑制作用可被外源性IGF-1恢復。
　　10.體外實驗中，PC-9/ER組瘤體大小明顯大于PC-9組(p＜0.05)，PC-9/ER-miR-223組明顯小于PC-9/ER-E