沉默NF-κB通路IKKβ、p65基因對Hp感染過表達FAF1胃癌細胞的調控作用研究.pdf

1、目的：
　　探討核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號傳導通路中IKKβ、p65基因沉默后對過表達Fas相關因子1（Fas associated factor1，F(xiàn)AF1）的HGC-27胃癌細胞的影響，以及NF-κB信號傳導通路在幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染相關性胃癌中的作用，從而明確Hp感染相關性胃癌中FAF1與NF-κB信號傳導通路之間的關系。
　　方法：

2、>　　構建針對IKKβ、p65的siRNA慢病毒表達載體（LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi），轉染過表達FAF1的HGC-27胃癌細胞株（Lenti-FAF1/HGC-27），實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白質印跡（Western blot）法檢測轉染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達水平變化。應用CCK8法檢測siRNA慢病毒轉

3、染后細胞增殖能力的變化。用Hp培養(yǎng)濾液感染經siRNA慢病毒轉染的細胞，用qRT-PCR和Western blot法檢測Hp感染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達水平變化。進一步采用Western blot法檢測Hp感染后NF-κB信號通路上IKKα/β、p65、IκBα及其相應磷酸化基因（P-IKKα/β，P-p65，P-IκBα）蛋白表達水平變化，酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorben

4、t assay，ELISA）檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）等炎性細胞因子濃度變化。
　　結果：
　　1.成功構建siRNA慢病毒表達載體LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi和LV-NC-RNAi，測序結果表明，構建的重組序列是正確的。
　　2.成功包裝出所需要的慢病毒濃縮液，轉染293T細胞后可見大量紅色熒

5、光產生。熒光法測定慢病毒滴度結果顯示LV-IKKβ-RNAi滴度為3×108TU/ml，LV-p65-RNAi滴度為6×108TU/ml，LV-NC-RNAi滴度為5×108TU/ml。
　　3．細胞分別轉染針對IKKβ和p65的siRNA慢病毒后，LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi組細胞原有的梭形形態(tài)變成不規(guī)則形，而空載轉染組（LV-NC-RNAi）細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。轉染后72 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率達

6、到90％。
　　4．細胞分別轉染針對IKKβ和p65的siRNA慢病毒后，LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi組IKKβ和p65 mRNA表達顯著低于LV-NC-RNAi組和未轉染組（P均＜0.01）。LV-NC-RNAi組與未轉染組IKKβ、p65 mRNA表達無顯著差異（P＞0.05）。轉染siRNA慢病毒后，各組間FAF1 mRNA表達無顯著差異（P＞0.05）。
　　5. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-NC-

7、RNAi組和未轉染組IKKβ、p65 mRNA和蛋白表達都顯著高于感染前（P＜0.01），而FAF1 mRNA和蛋白表達顯著低于感染前（P＜0.01）；Hp感染后LV-IKKβ-RNAi組和LV-p65-RNAi組IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表達與感染前相比無顯著差異（P＞0.05）。
　　6. CCK8實驗結果表明，與LV-NC-RNAi組和未轉染組相比，LV-IKKβ-RNAi組和LV-p65-RNAi組細胞增殖

8、水平明顯升高（P＜0.01），LV-NC-RNAi組和未轉染組細胞增殖水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　7. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi組NF-κB信號通路上IKKα/β、p65蛋白表達顯著低于未轉染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05），IκBα蛋白表達顯著高于未轉染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05）；磷酸化IKKα/β、p65、IκBα（P-IKKα/β，P-p65，P

9、-IκBα）蛋白表達顯著低于未轉染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.05）。LV-NC-RNAi組和未轉染組細胞蛋白水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　8. Hp培養(yǎng)濾液感染后，LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi組炎性細胞因子TNF-α、IL-8濃度顯著低于未轉染組和LV-NC-RNAi組（P＜0.01）。LV-NC-RNAi組與未轉染組TNF-α、IL-8表達無顯著差異（P＞0.05）。
　　結論：