間皮素在卵巢上皮癌中的診斷價(jià)值及負(fù)載間皮素的DC疫苗抗卵巢癌細(xì)胞效應(yīng)的研究.pdf

1、卵巢癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，90％的卵巢癌為卵巢上皮癌（Epithelial Ovarian Cancer，EOC），其死亡率居各種生殖器官腫瘤的首位。卵巢癌早期缺乏特異性癥狀，一旦確診往往已經(jīng)是晚期。早期患者5年生存率能夠達(dá)到90％，晚期患者的5年生存率僅為5-20％。絕大多數(shù)患者經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及紫杉醇與鉑類聯(lián)合化療后只能在一段時(shí)期內(nèi)病情得到緩解，最終出現(xiàn)化療抵抗而死亡。因此，尋找新的早期診斷篩查指標(biāo)、尋找特異有效的治療方

2、法是提高卵巢癌患者生存率亟待解決的問(wèn)題。
　　間皮素(Mesothelin, MSLN)是一種分子質(zhì)量為40KDa的細(xì)胞表面糖蛋白，通常只在人體體腔表面的間皮細(xì)胞表達(dá)，在其他正常組織中不表達(dá)，但是在一些惡性腫瘤如間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等中過(guò)度表達(dá)。研究證實(shí)間皮素在腫瘤細(xì)胞生存、侵襲和腫瘤進(jìn)展方面起著重要作用。間皮素與CA125有很高的親和力，二者共同作用參與細(xì)胞粘附，與腫瘤的腹腔種植轉(zhuǎn)移有關(guān)?？扇苄蚤g皮素相關(guān)蛋白(Soluble

3、mesothelin related protein，SMRP)是分子量為42-45KDa的蛋白，是由間皮素基因編碼蛋白的其中一個(gè)異構(gòu)體在翻譯過(guò)程中翻譯提前終止，從細(xì)胞表面脫落形成。SMRP分子量小，它不僅在血清中可以檢測(cè)到，在腹水和尿液中同樣可以檢測(cè)到。因此，SMRP有可能成為卵巢癌早期診斷的篩查指標(biāo)，而且間皮素組織特異性表達(dá)方式使它成為理想的腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。
　　腫瘤疫苗是免疫治療的重要組成部分，是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原誘

4、導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cell，DC）疫苗是腫瘤疫苗的一種。DC是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，能夠攝取腫瘤抗原，誘導(dǎo)生成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，從而介導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫。近幾年來(lái)，關(guān)于卵巢癌DC疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的成果。
　　本課題首先檢測(cè)卵巢上皮癌、良性卵巢上皮腫瘤、正常人群血清及尿液間皮素水平，將其與血清C

5、A125的臨床價(jià)值作同期比較;同時(shí)將尿液及血清間皮素分別聯(lián)合血清CA125檢測(cè)作為卵巢上皮癌診斷的臨床價(jià)值作出客觀評(píng)價(jià)。然后采用PCR技術(shù)克隆間皮素全長(zhǎng)的cDNA，通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列正確后，提取無(wú)內(nèi)毒素的間皮素質(zhì)粒，再制備負(fù)載間皮素cDNA的慢病毒載體，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。最后應(yīng)用負(fù)載人間皮素全長(zhǎng)cDNA的慢病毒感染DC，構(gòu)建卵巢上皮癌的新型DC疫苗，通過(guò)Western Blot技術(shù)驗(yàn)證病毒轉(zhuǎn)染的DC強(qiáng)烈表達(dá)間皮素，進(jìn)而通過(guò)DC作為間皮素的遞

6、送細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生具有間皮素特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，通過(guò)LDH釋放法、流式細(xì)胞術(shù)、IFN-γ檢測(cè)等一系列方法測(cè)定CTL對(duì)卵巢上皮癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。期望通過(guò)本課題研究為卵巢癌的早期診斷和免疫治療提供新的研究思路。
　　第一部分血清及尿液中間皮素檢測(cè)在卵巢上皮癌中的診斷價(jià)值
　　目的:檢測(cè)血清及尿液中的SMRP水平在卵巢上皮癌、良性卵巢上皮腫瘤及健康女性中的分布情況，并且與血清CA125的臨床診斷價(jià)值作比較，

7、同時(shí)將血清及尿液SMRP分別聯(lián)合血清CA125檢測(cè)作為卵巢上皮癌診斷的臨床價(jià)值作出客觀評(píng)價(jià)。
　　方法:用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)46例卵巢上皮癌患者、36例良性卵巢上皮腫瘤患者和35例健康女性血清和尿液中的SMRP水平，同時(shí)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CA125水平。分析血清SMRP及尿液SMRP在卵巢上皮癌患者不同病理類型、不同手術(shù)病理分期和不同病理分級(jí)的分布差異，也對(duì)良性卵巢上皮腫瘤不同病理類型患者分布作出比較。通過(guò)繪制ROC曲線對(duì)

8、三種檢測(cè)方法的診斷效能作出評(píng)價(jià)，并評(píng)價(jià)血清及尿液SMRP分別聯(lián)合血清CA125檢測(cè)的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1、卵巢上皮癌患者的血清SMRP(17.63±2.18ng/ml)和尿液SMRP(11.26±1.43 ng/ml)水平均高于良性卵巢上皮腫瘤患者(血清SMRP4.62±0.71ng/ml;尿液SMRP2.84±0.47ng/ml)和健康體檢者(血清SMRP2.99±0.36ng/ml;尿液SMRP0.89±0.3

9、1 ng/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、漿液性癌的血清SMRP水平顯著高于粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌間比較差異不顯著(P＞0.05)。三種病理類型的卵巢上皮癌患者的尿液SMRP水平比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、晚期癌患者血清和尿液SMRP水平均較早期患者明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、G3組的血清和尿

10、液SMRP水平均明顯高于G1組和G2組，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G1組和G2組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　5、繪制血清SMRP、尿液SMRP和血清CA125的ROC曲線，血清SMRP的ROC曲線下面積(Area under ROC curve，AUC)為0.822，標(biāo)準(zhǔn)誤0.42，其95％的可信區(qū)間為(0.740-0.905);尿液SMRP的AUC為0.787，標(biāo)準(zhǔn)誤0.46，其95％的可信區(qū)間為(0.6

11、97-0.877);血清CA125的AUC為0.814，標(biāo)準(zhǔn)誤0.49，其95％的可信區(qū)間為(0.719-0.910)。
　　6、血清CA125靈敏度最高(76.1％)，但其特異度最低(85.5％)。血清SMRP的靈敏度(71.7％)較CA125略低，特異度(89.8％)較其增加。尿液SMRP的特異度最高(93.4％)，敏感度最低(67.4)。
　　7、對(duì)三指標(biāo)進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，血清SMRP的Kappa值為0.617

12、(P=0.000)，尿SMRP的Kappa值為0.628(P=0.000)，CA125的Kappa值為0.590(P=0.000)。
　　8、血清SMRP與CA125進(jìn)行并聯(lián)聯(lián)合檢測(cè)靈敏度最高(93.2％)，尿液SMRP與CA125串聯(lián)聯(lián)合檢測(cè)特異度最高(99％)。三者的聯(lián)合使敏感度略增加，但并不能提高特異度。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢上皮癌組的血清SMRP水平顯著高于良性上皮性腫瘤組和健康對(duì)照組;漿液性癌患者較粘液性

13、癌和子宮內(nèi)膜樣癌患者血清SMRP水平顯著升高;晚期患者的血清SMRP水平顯著高于早期患者;組織學(xué)分級(jí)越差的患者血清SMRP水平越高。
　　2、卵巢上皮癌組的尿液SMRP水平顯著高于良性上皮性腫瘤組和健康對(duì)照組;漿液性癌患者較粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌患者尿液SMRP水平高，但是差異不顯著;晚期患者的尿液SMRP水平顯著高于早期患者;組織學(xué)分級(jí)越差的患者尿液SMRP水平越高。
　　3、三指標(biāo)比較，血清CA125靈敏度最高，但其特異

14、度最低。血清SMRP的靈敏度較CA125略低，特異度較其增加。尿液SMRP的特異度最高，但靈敏度最低。在診斷一致性方面，尿液SMRP優(yōu)于血清SMRP和血清CA125，血清SMRP略優(yōu)于CA125。證實(shí)了血清和尿液SMRP檢測(cè)用于診斷卵巢上皮癌的應(yīng)用價(jià)值。
　　4、血清SMRP與CA125進(jìn)行并聯(lián)聯(lián)合檢測(cè)靈敏度最高，尿液SMRP與CA125串聯(lián)聯(lián)合檢測(cè)特異度最高。血清、尿液SMRP檢測(cè)可以在一定程度上彌補(bǔ)CA125作為卵巢癌早期診斷

15、標(biāo)志物的不足。
　　第二部分間皮素cDNA的克隆及慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建負(fù)載間皮素全長(zhǎng)cDNA的慢病毒載體。
　　方法:應(yīng)用PCR技術(shù)克隆間皮素基因全長(zhǎng)序列的cDNA，通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列正確后，構(gòu)建pBOB-1質(zhì)粒表達(dá)載體，再制備負(fù)載間皮素cDNA的慢病毒載體，并對(duì)其進(jìn)行滴度檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過(guò)兩輪PCR獲到了大約2000bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得了編碼間皮素(MSLN)的cDNA

16、全長(zhǎng)序列，其編碼區(qū)為1893 bp，編碼630個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
　　2、將MSLN編碼區(qū)cDNA兩端分別含有AgeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物和經(jīng)過(guò)雙酶切的pBOB-1質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得了用于轉(zhuǎn)染慢病毒的pBOB-MSLN質(zhì)粒載體，并用微量分光光度計(jì)K5600檢測(cè)質(zhì)粒的純度。
　　3、成功構(gòu)建MSLN全長(zhǎng)基因cDNA的慢病毒載體，用定量PCR方法測(cè)定病毒顆粒的滴度為6.56×106±2.1×105TU/ml。<

17、br>　　結(jié)論:
　　1、使用含有人間皮素編碼基因的cDNA文庫(kù)菌體，采用PCR擴(kuò)增的方法，經(jīng)過(guò)兩輪PCR得到的產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得了編碼間皮素(MSLN)的cDNA全長(zhǎng)序列。
　　2、本實(shí)驗(yàn)中使用的慢病毒載體系統(tǒng)是四質(zhì)粒系統(tǒng)的pBOB(pCSC-SP-PW)，并用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒。該載體具有宿主范圍廣，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)

18、到持久性表達(dá)。構(gòu)建負(fù)載間皮素全長(zhǎng)cDNA的慢病毒載體成功后檢測(cè)病毒滴度滿意。
　　第三部分負(fù)載間皮素全長(zhǎng)cDNA的DC疫苗抗卵巢癌細(xì)胞OVCAR3和 SKOV3效應(yīng)的研究
　　目的:構(gòu)建負(fù)載間皮素全長(zhǎng)cDNA的DC疫苗，利用DC的抗原遞呈功能，以成熟DC為載體將間皮素遞呈給淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)間皮素的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，驗(yàn)證其對(duì)卵巢上皮癌腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的特異性細(xì)胞殺傷作用。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)卵巢

19、癌細(xì)胞株OVCAR3和SKOV3，用Western Blot方法測(cè)定兩個(gè)細(xì)胞株間皮素的表達(dá)情況。
　　2、成熟DC的獲得和檢測(cè):從外周健康新鮮血中分離獲得人外周血單核細(xì)胞，先后加入GM-CSF、IL-4、TNF-α等細(xì)胞因子培養(yǎng)9天，收獲成熟的DC。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)成熟DC表面的CD80，CD83，CD86分子表達(dá)情況。
　　3、重組慢病毒感染DC:用構(gòu)建好的負(fù)載間皮素全長(zhǎng)cDNA的慢病毒載體感染成熟DC（未感染的DC作為陰

20、性對(duì)照），Western Blot方法檢測(cè)MSLN在DC中的表達(dá)。
　　4、CTL細(xì)胞的獲得:將負(fù)載MSLN的慢病毒感染的DC及未感染的DC分別加入從外周健康新鮮血中分離獲得的人外周血單核細(xì)胞中孵育，并補(bǔ)充重組人IL-2，第7天收集CTL。
　　5、LDH釋放法測(cè)定CTL的功能:將DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL分別與OVCAR3或SKOV3按照不同的E∶T比率孵育。通過(guò)對(duì)損傷的OVCAR3或SKOV3細(xì)胞中釋放的

21、LDH測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)CTL對(duì)OVCAR3或SKOV3的細(xì)胞毒作用。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡率:用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡率來(lái)驗(yàn)證CTL對(duì)OVCAR3或SKOV3的細(xì)胞毒作用。
　　7、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ的釋放量:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)的CTL產(chǎn)生IFN-γ的能力，用沒(méi)有轉(zhuǎn)染的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL作為對(duì)照。
　　結(jié)果:
　　1、間皮素在OVCAR3和SKOV3細(xì)

22、胞中均有表達(dá)，其中在卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3的表達(dá)高于SKOV3。
　　2、培養(yǎng)第9天成熟的顯微鏡下可以見(jiàn)到典型的成熟DC的形態(tài)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成熟DC表面的CD分子抗體，結(jié)果顯示，83.07％的DC細(xì)胞表達(dá)CD80，85.80％的DC細(xì)胞表達(dá)CD86，有52.42％的DC細(xì)胞表達(dá)CD83。
　　3、Western Blot方法檢測(cè)MSLN在DC中的表達(dá)。結(jié)果顯示，間皮素在病毒轉(zhuǎn)染的DC中表達(dá)，而在未轉(zhuǎn)染的DC中不表達(dá)。

23、
　　4、間皮素特異性CTL對(duì)這兩種卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用隨著E:T比例增高也明顯升高。同時(shí)，在比例為50∶1和10∶1時(shí)，對(duì)OVCAR3的細(xì)胞毒性明顯高于SKOV3。說(shuō)明間皮素修飾過(guò)的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)OVCAR3表現(xiàn)出高效的間皮素特異的細(xì)胞毒性。
　　5、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡率:效應(yīng)細(xì)胞CTL在完成殺傷后已大部分死亡;OVCAR3和SKOV3兩種靶細(xì)胞在自然釋放條件下結(jié)果OVCAR3和SKOV3細(xì)胞的自然釋放凋

24、亡率分別為23.31％和6.8％;MSLN誘導(dǎo)的CTL對(duì)兩種靶細(xì)胞均有非常顯著的誘導(dǎo)凋亡的作用，且隨著效靶比的增高凋亡率也明顯提高，并且OVCAR3細(xì)胞比SKOV3細(xì)胞凋亡率更高;未用MSLN誘導(dǎo)的CTL對(duì)OVCAR3和SKOV3也有一定的誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　6、與對(duì)照組相比，DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL釋放更多的IFN-γ，兩者相比，差異有顯著性（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的DC檢