LSD1對(duì)TGF-β1和Wnt通路以及EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控作用研究.pdf

1、組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1（Histone lysine specific demethylase1，LSD1）是2004年由Shi Yang教授課題組首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的一個(gè)賴氨酸特異性去甲基化酶。TGF-β1（transforming growth factor beta1，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1）和Wnt信號(hào)通路都參與了不同的組織細(xì)胞或功能器官的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本文研究LSD1對(duì)經(jīng)典的TG

2、F-β1和Wnt信號(hào)通路以及對(duì)EMT（epithelial-mesenchymal transition，上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換）過(guò)程的影響。
　　1) LSD1對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響
　　課題組前期在探索侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞 MGC-803中TGF-β1正向調(diào)控LSD1的表達(dá)，而在胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中，TGF-β1對(duì)LSD1表達(dá)的調(diào)控作用并不明顯。本課題將進(jìn)一步探究LSD1對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響，

3、以期了解LSD1和TGF-β1在胃癌細(xì)胞及正常胃細(xì)胞中調(diào)控機(jī)制的異同。首先利用脂質(zhì)體2000（Lipofectamine?2000，Lipo2000）和脂質(zhì)體3000（Lipofectamine?3000，Lipo3000）將構(gòu)建好的LSD1過(guò)表達(dá)和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞MGC-803和GES-1，然后用Elisa實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá)：兩株細(xì)胞中，LSD1低表達(dá)后TGF-β1蛋白表達(dá)均下調(diào)，LSD1過(guò)表達(dá)后TGF-β1蛋白表達(dá)均

4、有所上調(diào)。同時(shí)進(jìn)行 ChIP-qPCR（染色體免疫沉淀，chromatin immunoprecipitation assay，ChIP；實(shí)時(shí)熒光定量PCR，Real-time Quantitative PCR，qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩株細(xì)胞中 LSD1低表達(dá)后 LSD1和TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)之間的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)周圍的H3K4me2和H3K9me2水平都升高，后者更明顯。說(shuō)明MGC-803中 LSD1與 TGF-β1之間

5、的相互作用屬于正相關(guān)調(diào)控，GES-1中二者作用與之不同。同時(shí)也證實(shí)了LSD1調(diào)控TGF-β1是與基因啟動(dòng)子附近的甲基化水平高低相關(guān)的。
　　2) LSD1對(duì)Wnt通路相關(guān)抑制因子和關(guān)鍵蛋白的表達(dá)影響
　　前期文獻(xiàn)研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞中 LSD1可抑制 Wnt抑制劑 DKK1的轉(zhuǎn)錄，從而激活Wnt通路。胃癌細(xì)胞中LSD1對(duì)Wnt通路的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本課題在細(xì)胞水平探討研究胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LSD1對(duì)Wnt/β-cateni

6、n通路中相關(guān)蛋白的調(diào)控作用及其機(jī)制。在慢病毒載體建立的LSD1 knockdown（KD）細(xì)胞系中利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到 Wnt通路相關(guān)抑制因子 SFRP1，2，4，5（Secreted frizzled-related protein1，2，4，5）、DKK1（DickKDpf1）、WIF-1（Wnt inhibitory factor1），Wnt蛋白（Wnt3a）和蛋白β-catenin的mRNA表達(dá)有明顯變化。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)查找LS

7、D1和Wnt通路相關(guān)抑制因子啟動(dòng)子區(qū)之間的結(jié)合聯(lián)系，利用H3K4me2和H3K9me2抗體進(jìn)行ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LSD1低表達(dá)之后，發(fā)現(xiàn)Wnt通路相關(guān)抑制因子啟動(dòng)子周圍的H3K4和H3K9甲基化水平有變化。結(jié)果說(shuō)明了Wnt通路相關(guān)抑制因子的變化與其基因啟動(dòng)子附近的甲基化水平高低有一定相關(guān)性，但是具體的作用機(jī)制尚未明確。
　　3) LSD1對(duì)Wnt蛋白和Wnt3a/β-catenin通路的作用
　　在慢病毒載體建立的L

8、SD1 KD細(xì)胞系 MGC-803和GES-1中，利用Western Blot，Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt3a的表達(dá)發(fā)現(xiàn)LSD1低表達(dá)影響Wnt3a的分泌。分別加入PORCN（Porcupine）抑制劑Wnt-C59和Wnt3a/β-catenin通路抑制劑水飛薊賓作用48 h，Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的變化。MGC-803中Wnt-C59抑制LSD1低表達(dá)引起的Wnt3a分泌，Totalβ-catenin、p-β-caten

9、in和Total LRP6幾乎不變，加入水飛薊賓，Total LRP6和Totalβ-catenin減少明顯。GES-1中加入 Wnt-C59并未抑制 LSD1低表達(dá)引起的Wnt3a分泌，Totalβ-catenin和p-β-catenin不變，加入水飛薊賓，Total LRP6和Totalβ-catenin的變化與 MGC-803中不同。兩株細(xì)胞中檢測(cè)核內(nèi) p-β-catenin發(fā)現(xiàn)同一時(shí)間點(diǎn)LSD1低表達(dá)或加入水飛薊賓胞核中 p-β

10、-catenin的表達(dá)增加，不同時(shí)間點(diǎn)p-β-catenin先升高后降低。分析結(jié)果可知LSD1低表達(dá)影響Wnt3a分泌的同時(shí)抑制Wnt3a/β-catenin通路。
　　4) LSD1低表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)志蛋白的作用
　　課題組前期工作表明細(xì)胞MGC-803中LSD1促進(jìn)EMT過(guò)程的發(fā)生，本課題注重探究LSD1低表達(dá)對(duì)EMT的影響，以及在細(xì)胞MGC-803和GES-1中的異同。在LSD1 KD細(xì)胞系MGC-803和GES-1中利

11、用Western Blot檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MGC-803中E-cadherin上調(diào)明顯，GES-1中EMT相關(guān)蛋白變化不大。說(shuō)明MGC-803中LSD1對(duì)EMT進(jìn)行正相關(guān)調(diào)控，GES-1中LSD1對(duì)EMT的調(diào)控并不明確。因此LSD1是否介導(dǎo)Wnt通路的EMT過(guò)程有待進(jìn)一步研究。
　　生命現(xiàn)象的調(diào)控具有復(fù)雜性，本課題將抗腫瘤新型靶點(diǎn)LSD1與研究較為成熟的TGF-β1通路和Wnt通路聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)行相關(guān)蛋白的調(diào)