蛋白酶激活受體4在肥大細胞介導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感性疼痛的作用和調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的：
　　蛋白酶激活受體4(protease-activated receptors4，PAR4)為G蛋白偶聯(lián)受體，參與多種病理生理的過程。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶活化受體4(PAR4)具有抑制內(nèi)臟痛和內(nèi)臟高敏感作用。由于PAR4通過G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，應(yīng)該能夠找到其在內(nèi)臟痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的下游效應(yīng)細胞。最近研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞(mast cells，MC)在腸易激綜合癥(IBS)內(nèi)臟高敏感的發(fā)生與肥大細胞活化以及PAR4表達下調(diào)密切相關(guān)，

2、推測肥大細胞可能是PAR4參與內(nèi)臟鎮(zhèn)痛的下游效應(yīng)靶點，PAR4可能通過作用于肥大細胞介導(dǎo)內(nèi)臟痛覺信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而其內(nèi)臟鎮(zhèn)痛作用是否直接與肥大細胞活化還不清楚。本研究以內(nèi)臟高敏感大鼠為研究模型，觀察PAR4活化對腸肥大細胞活化的調(diào)節(jié)作用；以探討PAR4活化對胃腸道內(nèi)臟高敏感誘發(fā)的痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，從而為IBS病人內(nèi)臟高敏感性疼痛的治療提供一個新的靶點。
　　材料與方法：
　　1、采用結(jié)直腸擴張(colorectal dist

3、ension,CRD)的方法建立IBS內(nèi)臟高敏感動物模型，并通過腹部撤回反射（abdominal withdrawal reflex,AWR）評分標(biāo)準(zhǔn)，進行半定量評分、篩選建立模型成功的動物。對達標(biāo)模型利用BL420-F生物機能實驗系統(tǒng)進行肌電圖(electromyography,EMG)檢測。
　　2、IBS模型給予PAR4激動劑(AYPGKF-NH2,PAR4-AP)(100μM，200μl)直腸內(nèi)注射，并通過AWR評分標(biāo)準(zhǔn)，

4、進行半定量評分。利用BL420-F生物機能實驗系統(tǒng)再次進行EMG檢測。
　　3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合甲苯胺藍染色技術(shù)觀察正常大鼠、IBS大鼠模型和IBS大鼠模型結(jié)腸內(nèi)注射PAR4-AP后觀察大鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)PAR4活化對NOS和P2X7在肥大細胞的表達的影響，比較正常組、IBS組、PAR4-AP組之間的表達差異。
　　4、免疫細胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察PAR4、NOS、P2X7和類胰蛋白酶(Tryptase

5、，AA4)在大鼠結(jié)腸和盲腸組織內(nèi)和肥大細胞或肓腸組織內(nèi)的共表達，觀察PAR4活化對NOS、P2X7陽性標(biāo)記肥大細胞的影響。
　　5、急性分離SD大鼠雙側(cè)股骨，骨髓干細胞定向誘導(dǎo)分化的方法培養(yǎng)骨髓源性肥大細胞(bone-marrow-derived mast cell,BMMC)。PAR4-AP孵育培養(yǎng)的肥大細胞24h，流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察PAR4活化對肥大細胞表達PAR4、NOS和P2X7的影響。
　　6、大鼠I

6、BS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP，TRIZOL提取正常組、IBS組、PAR4-AP組直腸、結(jié)腸和盲腸組織的總RNA，用實時熒光定量PCR法檢測PAR4活化對IL-1的基因表達變化的影響。
　　7、大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP，RIPA細胞裂解液提取正常組、IBS組、PAR4-AP組直腸、結(jié)腸和盲腸組織的總蛋白，Western blot法檢測NOS、P2X7和PAR4的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1、PAR4活

7、化對IBS大鼠內(nèi)臟高敏感性疼痛的作用
　?。?）直結(jié)腸擴張后AWR評分。與正常組相比，IBS組SD大鼠的AWR評分升高，內(nèi)臟疼痛敏感性升高；PAR4激動組的AWR評分較IBS組降低，說明PAR4激動劑可以降低內(nèi)臟高敏感性。
　?。?）腹直肌肌電檢測。結(jié)果顯示大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP能明顯降低直腸擴張誘發(fā)的肌電圖和平均峰值的曲線面積(area under the curve，AUC)。直腸擴張在20mmHg的壓力

8、下IBS組與PAR4激動組之間有差異，IBS組與正常組之間有差異；在40mmHg的壓力下各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；在60mmHg的壓力IBS組與PAR4激動組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、PAR4活化對IBS大鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)NOS和P2X7陽性肥大細胞的影響
　?。?）PAR4陽性細胞的變化。IBS組盲腸中PAR4陽性細胞數(shù)高于正常組和PAR4激動組；PAR4激動組高于正常組。
　　（2）肥大細胞的變化。IBS組盲腸

9、中Tryptase陽性肥大細胞數(shù)量明顯高于正常組和PAR4激動組。
　?。?）NOS陽性細胞的變化。IBS組盲腸中NOS陽性細胞數(shù)高于正常組；PAR4激動組高于正常組；PAR4激動組與IBS組盲腸中NOS陽性細胞數(shù)沒有明顯差異。
　?。?）P2X7陽性細胞的變化。IBS組盲腸中P2X7陽性細胞數(shù)高于正常組和PAR4激動組；PAR4激動組高于正常組。
　　3、PAR4、NOS和P2X7在IBS大鼠腸粘膜或培養(yǎng)肥大細胞的表

10、達
　　免疫細胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡顯示在IBS大鼠模型腸粘膜或骨髓干細胞定向誘導(dǎo)分化法培養(yǎng)的肥大細胞表達PAR4、NOS和P2X7?？梢夾A4分別與PAR4、NOS和P2X7共存。
　　4、PAR4活化對肥大細胞的影響
　?。?）PAR4激動劑對PAR4在肥大細胞內(nèi)表達的影響。Western blotting和流式細胞技術(shù)顯示，PAR4激動劑使培養(yǎng)的肥大細胞PAR4蛋白的表達明顯增加。
　　（2）PAR

11、4激動劑對NOS在肥大細胞表達的影響。Western blotting和流式細胞技術(shù)顯示，PAR4激動劑使使培養(yǎng)的肥大細胞NOS表達明顯增加。
　　5、PAR4活化下調(diào)IL-1βmRNA表達。
　　實時定量PCR技術(shù)檢測顯示大鼠IBS模型直腸內(nèi)注射PAR4-AP能明顯降低IL-1βmRNA水平。IBS組IL-1β基因表達量明顯高于對照組正常組，PAR4-AP組大鼠腸組織中IL-1β基因表達量介于IBS組與正常對照組之間。