五味子醇甲對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞舒張功能障礙的保護作用.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），建立高糖損傷模型，用不同濃度的五味子醇甲在高糖刺激前對細胞進行預處理，觀察HUVECs的形態(tài)，測定 RhoA蛋白活性并檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性及一氧化氮（NO）的分泌水平，探討五味子醇甲對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞舒張功能障礙修復的可能機制及其干預作用機制。
　　方法：選取人臍靜脈內(nèi)皮細胞株為研究對象，細胞傳代12h貼壁后，分為5組：1)正常對照組：葡萄糖終濃度為5.

2、5mmol/L；2)高糖組：葡萄糖終濃度為30mmol/L；3)高糖+低劑量五味子醇甲組（5μmol/L）；4)高糖+中劑量五味子醇甲組（10μmol/L）；5)高糖+高劑量五味子醇甲組（20μmol/L）。藥物在高糖處理前24小時加入培養(yǎng)基對細胞進行預處理，高糖處理48h后收集細胞及上清，光鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化；免疫細胞化學檢測磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1（p-MYPT1）的表達水平；RhoA活性檢測試劑盒測定RhoA活性；

3、一氧化氮合酶（NOS）活性檢測試劑盒測定eNOS活性；硝酸還原法測定NO濃度。
　　結果：⑴本實驗中GTP-RhoA及p-MYPT1代表了RhoA/Rho激酶被活化。在正常的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，p-MYPT1以基礎水平表達在細胞漿中，經(jīng)過高糖48h刺激后，細胞質(zhì)著染棕黃色，表達信號明顯增強，不同濃度五味子醇甲預處理后， p-MYPT1表達信號逐漸下降至接近正常水平。Western blotting結果顯示：正常對照組可檢測到少量G

4、TP-RhoA，高糖刺激后GTP-RhoA水平較正常對照組增加（P<0.01），5μmol/L的五味子醇甲預處理組與高糖組的GTP-RhoA水平無顯著差異（P>0.05），而五味子醇甲預處理組（10μmol/L及20μmol/L）顯著減少了 GTP-RhoA水平（P<0.01），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中20μmol/L的五味子醇甲預處理組與正常組的GTP-RhoA水平無明顯差異（P>0.05）。結果表明：高糖可提高

5、HUVECs的RhoA活性及增加p-MYPT1的表達，用一定濃度范圍內(nèi)的五味子醇甲對細胞預處理后，可降低RhoA活性，減少p-MYPT1的表達；⑵與正常對照組相比，高糖組NO的分泌量及eNOS活性明顯下降，且均有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；5μmol/L五味子醇甲預處理組與高糖組相比較，NO分泌量及eNOS活性均無明顯差別（P>0.05）；而五味子醇甲預處理組（10μmol/L和20μmol/L）的NO分泌量及eNOS活性較高糖組明顯升

6、高（ P<0.01），呈藥物濃度依賴性，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），此外20μmol/L的五味子醇甲預處理組的NO分泌量及eNOS活性與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果表明：高糖抑制了HUVECs的eNOS活性，減少了NO的分泌，對細胞進行五味子醇甲預處理后，在一定范圍內(nèi)可濃度依賴地提高高糖損傷后細胞的eNOS活性，促進其分泌NO。
　　結論：①高糖所致的內(nèi)皮細胞功能紊亂可能與RhoA/Rho激