葡萄糖再灌注誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷與線粒體功能障礙的關(guān)系.pdf

1、糖尿病是近年來嚴(yán)重危害人類健康的慢性代謝性疾病,其中糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病的主要致殘及致死因?yàn)?。如何減少和延緩糖尿病患者血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展迫在眉睫。控制血糖是糖尿病治療的首要措施,但在降糖過程中,難以避免的低血糖會(huì)減少降糖益處,甚至可能增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。近期大規(guī)模強(qiáng)化降糖研究結(jié)果提示,強(qiáng)化降糖與嚴(yán)重低血糖發(fā)生率增加密切相關(guān)；強(qiáng)化降糖不但沒有減少心血管疾病的發(fā)生率,反而增加了全因死亡率。因此,強(qiáng)化血糖控制引起的低血糖可能也是導(dǎo)致心血管疾

2、病風(fēng)險(xiǎn)增加的一個(gè)重要因素。
　　 既往研究顯示,低糖可以直接損傷神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,其損傷機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。我科前期研究也提示低糖能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激而直接導(dǎo)致?lián)p傷了內(nèi)皮細(xì)胞ECV304。因此,低血糖對(duì)機(jī)體的危害值得引起臨床醫(yī)生的高度重視。
　　 低血糖后及時(shí)給予葡萄糖是臨床醫(yī)生的積極對(duì)癥處理手段。但近年來國(guó)外有研究顯示,低糖后給予葡萄糖再灌注可以直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,而且這種損傷作用明顯高于低糖本身。我

3、們將這種低糖后再補(bǔ)充葡萄糖導(dǎo)致的細(xì)胞或組織損傷稱為葡萄糖再灌注損傷(Glucose-reperfusion injury)。目前普遍認(rèn)為血管性疾病的發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙有著密切的聯(lián)系。如前所述,低血糖可顯著增加糖尿病心血管事件的發(fā)生。而且我科既往研究已經(jīng)提示低糖能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平升高而直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞ECV304。那么低糖后給予葡萄糖再灌注是否可誘導(dǎo)和(或)進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷,從而導(dǎo)致血管性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加,目前尚未見此類

4、報(bào)道。
　　 大量研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與氧化應(yīng)激相關(guān)。氧化應(yīng)激的產(chǎn)物活性氧(ROS)主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)、一氧化氮(NO)等。ROS過多可直接引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)變性膠連、DNA斷裂,引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙。ROS過多還可以導(dǎo)致低密度脂蛋白(LDL)被氧化修飾成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。
　　 線粒

5、體是細(xì)胞內(nèi)活性氧的重要來源之一。電子經(jīng)過線粒體呼吸鏈傳遞時(shí),質(zhì)子(H+)順濃度梯度回流至線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè),產(chǎn)生線粒體膜電位,以此儲(chǔ)存能量。線粒體跨膜電位對(duì)維持線粒體正常功能是必要的,是研究線粒體功能及其氧化應(yīng)激損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)外研究表明,氧化應(yīng)激水平與線粒體膜電位水平呈正相關(guān)；使質(zhì)子返流入基質(zhì)能降低膜電位,導(dǎo)致線粒體ROS的形成大量減少。生理狀態(tài)下,大多數(shù)電子經(jīng)過呼吸鏈傳遞并最終與氧和質(zhì)子形成水；小部分電子從呼吸鏈的底物端漏出直

6、接還原氧分子形成超氧陰離子(O2-)。線粒體在正常生理狀態(tài)下產(chǎn)生少量的活性氧用于維護(hù)細(xì)胞的正常的生理功能。但在病理?xiàng)l件下,線粒體呼吸鏈電子傳遞阻力增大,致使電子發(fā)生泄漏而產(chǎn)生大量ROS,活性氧生成過多會(huì)引起細(xì)胞損傷。
　　 在正常情況下,過多的活性氧可被機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)所清除；病理?xiàng)l件下體內(nèi)的抗氧化酶活性明顯下降,抗氧化防御機(jī)制被攻潰,由此會(huì)加劇氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷。超氧化物歧化酶(SOD)作為重要的抗氧化酶,能夠與超氧陰離

7、子相結(jié)合并與其發(fā)生歧化反應(yīng),使其變?yōu)闊o活性的產(chǎn)物。越來越多的研究結(jié)果表明,病理?xiàng)l件下SOD因發(fā)揮抗氧化作用而造成其活性下降。在真核生物中,位于線粒體內(nèi)的MnSOD憑借其特殊的位置成為防護(hù)線粒體氧化損傷的第一道防線,因而研究MnSOD的活性變化具有重要意義。
　　 綜上所述,在高糖、低糖等條件下可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平升高從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。那么葡萄糖再灌注是否同樣可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷呢?這種損傷作用和線粒體的關(guān)系如何呢?目前關(guān)

8、于這方面的研究未見報(bào)道。本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12細(xì)胞作為內(nèi)皮細(xì)胞研究模型,觀察葡萄糖再灌注條件下HUVEC-12細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量和線粒體功能的改變,以期探索葡萄糖再灌注對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及其可能機(jī)制,為保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的研究提供新的思路。
　　 第1章葡萄糖再灌注誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　 [目的]
　　 觀察葡萄糖再灌注條件HUVEC-12細(xì)胞內(nèi)NO含量和ROS含量的變化

9、,初步探討葡萄糖再灌注對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1、以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12細(xì)胞為研究對(duì)象,采用10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37.5℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。
　　 2、葡萄糖再灌注實(shí)驗(yàn)分為7組:
　　 ①正常對(duì)照組(5.5mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②持續(xù)無

10、糖組(0mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ③葡萄糖再灌注Ⅰ組(0-5.5 mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ④葡萄糖再灌注Ⅱ組(0-11.1 mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ⑤葡萄糖再灌注Ⅲ組(0-25 mM組

11、,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ⑥持續(xù)高糖Ⅰ組(11.1mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為11.1mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ⑦持續(xù)高糖Ⅱ組(25mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為25mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 以上各組正式干預(yù)前均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),以保持各組細(xì)胞同步化生長(zhǎng),各組均干預(yù)2小時(shí)15分鐘。

12、r>　　 3、細(xì)胞上清總一氧化氮(NO)含量檢測(cè):采用硝酸酶還原法測(cè)定NO2-/NO3-水平,嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。
　　 4、細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定:HUVE-12細(xì)胞以每孔2×104種于十二孔板,采用超氧陰離子熒光探針Dihydroethidium(DHE)標(biāo)記細(xì)胞,37℃孵育1h后用PBS緩沖液洗滌3次,立即用微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(SpectraMax M5/M5e)在激發(fā)波535nm,發(fā)射波610nm測(cè)定細(xì)胞在不同濃度葡萄

13、糖干預(yù)后,在不同時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)熒光量的變化,間接反映ROS產(chǎn)量。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組資料比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)。若差異有顯著性,任意兩組間比較當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用LSD法(Least-significant difference test)。,不滿足方差齊性要求時(shí)用Tamhane’s T2法進(jìn)行檢驗(yàn)。P<

14、0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、各組細(xì)胞NO含量:5.5mM組、0mM組、0—5.5mM組、0-11.1mM組、0-25mM組、11.1mM組、25mM組的NO含量分別是103.63±5.82、45.06±2.73、105.56±5.10、19.57±1.60、17.47±1.74、29.45±0.74、26.35±6.28。不同干預(yù)條件下各組間NO含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=277.305,

15、P=0.000)；與5.5mM組相比,0-11.1mM組、0-25mM組NO含量均顯著下降(P均<0.000)；且0-11.1mM組NO含量顯著低于0mM組和11.1mM組(P均<0.01)；0-25mM組NO含量顯著低于0mM組和25mM組(P均<0.05)。
　　 2、各組細(xì)胞ROS產(chǎn)量:5.5mM組、0mM組、0-5.5mM組、0-11.1 mM組、0-25mM組、11.1mM組、25mM組的ROS產(chǎn)量分別是0.56±0.

16、06、0.88±0.07、0.66±0.08、0.67±0.16、1.35±0.12、0.47±0.06、0.82±0.26。不同干預(yù)條件下各組間 ROS產(chǎn)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.993,P=0.000)；隨著葡萄糖再灌注濃度的升高,與0-5.5mM組和0-11.1mM組比較,0-25mM組ROS產(chǎn)量顯著增加(P均=0.000)；且0-25mM組ROS產(chǎn)量顯著高于0mM組、11.1mM組和25mM組(P均<0.01)。
　　

17、 [結(jié)論]
　　 1、葡萄糖再灌注導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著降低,提示葡萄糖再灌注可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
　　 2、葡萄糖再灌注可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高。與持續(xù)低糖組和持續(xù)高糖組相比,葡萄糖再灌注組ROS產(chǎn)量升高更明顯。這一結(jié)果與葡萄糖再灌注導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO含量變化呈負(fù)相關(guān),提示葡萄糖再灌注可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
　　 第2章葡萄糖再灌注誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制與線粒體功能

18、的關(guān)系
　　 [目的]
　　 觀察葡萄糖再灌注條件下HUVEC-12細(xì)胞ROS產(chǎn)量、線粒體膜電位(MMP)和線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)活性的變化,然后通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位,觀察ROS含量和MnSOD活性的變化,初步探討線粒體功能改變對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1、研究對(duì)象同第一章。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組:將HUVEC-12細(xì)胞正常培養(yǎng)24小時(shí)后,換用無血清培養(yǎng)

19、基培養(yǎng)24小時(shí)(血清饑餓)保持細(xì)胞同步生長(zhǎng),待細(xì)胞至對(duì)數(shù)期后,開始用不同的完全培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為兩部分:
　　 第一部分:
　　 ①正常對(duì)照組(5.5mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②葡萄糖再灌注Ⅰ組(0-5.5mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注)
　　 ③葡萄糖再灌注Ⅱ組(0-11.1mM組

20、,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注)
　　 ④葡萄糖再灌注Ⅲ組(0-25mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注)
　　 每組均于再灌注后的5min,10min,15min時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ROS產(chǎn)量和MMP水平；同時(shí)在再灌注后15min檢測(cè)MnSOD活性。
　　 第二部分:
　　 ①正常對(duì)照組(5.5mM

21、組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②葡萄糖再灌注A組(0-25mM組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注)
　　 ③葡萄糖再灌注B組(0-25mM+CCCP組,細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注+解耦聯(lián)劑CCCP0.05μM)
　　 每組各組均干預(yù)2小時(shí)15分鐘,于再灌注后

22、的15min檢測(cè)ROS產(chǎn)量、MMP水平和MnSOD活性。
　　 3、細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量測(cè)定同第一章。
　　 4、線粒體膜電位(MMP)測(cè)定:采用熒光探針Rhodamine123測(cè)定法檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒說明書要求進(jìn)行。細(xì)胞接種于12孔板,調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×104。經(jīng)過干預(yù)處理后,移除培養(yǎng)基,加入含有1％熒光探針基礎(chǔ)培養(yǎng)液,置于325℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育1h,PBS洗三遍,在激發(fā)波長(zhǎng)為508 nm,發(fā)射波長(zhǎng)529

23、nm條件下,用微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(SpectraMax M5/M5e)檢測(cè)各樣本平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
　　 5、線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)活性檢測(cè):采用黃嘌呤氧化酶檢測(cè)法,嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,2小時(shí)15分鐘內(nèi)的ROS產(chǎn)量和MMP水平采用連續(xù)性重復(fù)測(cè)量的方差分析,并考慮交互效應(yīng)及主效應(yīng)影響；若交互效應(yīng)顯著,則進(jìn)

24、一步兩兩比較分析。多組資料比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步多重比較采用LSD法。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、0-25mM組與5.5mM組、0-5.5mM組、0-11.1mM組相比,ROS產(chǎn)量和MMP水平升高顯著(P均<0.000),且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),ROS產(chǎn)量和MMP水平逐漸升高,15min升至最高水平。而0-25mM+CCCP組與0-25mM組相比,

25、ROS產(chǎn)量和MMP水平分別下降17％(P<0.05)、45％(P=0.001)。
　　 2、MnSOD活性的變化:與5.5mM組相比,0-5.5mM組、0-11.1mM組、0-25mM組的MnSOD活性分別下降11％、12％、25％(P均<0.05),且0-25mM組與0-5.5mM組、0-11.1mM組相比,MnSOD活性下降顯著(P均<0.01):而0-25mM+CCCP組與0-25mM組相比,MnSOD活性顯著升高23％(

26、P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、葡萄糖再灌注可導(dǎo)致線粒體膜電位水平明顯升高。
　　 2、葡萄糖再灌注條件下,線粒體膜電位水平與該條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS含量呈正相關(guān)。提示:葡萄糖再灌注可能通過影響線粒體膜電位誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多。
　　 3、葡萄糖再灌注可導(dǎo)致MnSOD活性明顯下降。
　　 4、通過調(diào)節(jié)MMP的水平,葡萄糖再灌注組ROS產(chǎn)量和MnSOD活性均有顯著下降。提示:線粒