Sirt3對AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老及功能障礙作用的研究.pdf

1、背景：
　　血管內皮細胞作為血管壁與血液之間的屏障，具有抗凝、調節(jié)血管張力參與炎癥反應等作用。血管內皮細胞損傷主要是指一氧化氮NO減少引起的內皮細胞舒張功能減退。內皮細胞功能損傷被認為是高血壓、冠心病等心血管疾病的早期發(fā)病機制。衰老內皮細胞增殖、遷移及舒張能力下降，進而導致血管內皮細胞的損傷修復、血管生成、內分泌及血管舒張功能等受損，是心腦血管疾病隨年齡增加的主要因素之一。AngⅡ作為RAAS系統(tǒng)中最主要的生物效應分子，可以直接或

2、間接的調節(jié)NADPH氧化酶的活性，引起ROS的生成增多，導致血管內皮損傷并誘導內皮細胞的衰老。
　　沉默信息調節(jié)因子2蛋白(silent mating type information regulation2 protein，Sirtuin)家族是廣泛存在于原核生物和真核生物中的依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的組蛋白去乙?；?，其在進化上高度保守。哺乳動物Sirtuin家族共有7個家族成員，分別為Sirt1～7，每個蛋白的細胞

3、靶點和細胞定位不同。Sirt3主要定位于線粒體基質和細胞核中。它激活被證實與延長人類壽命相關。其組織器官分布非常廣泛，在物質代謝活躍的組織如肌肉、肝臟、腎臟和心臟中表達較高。研究表明，Sirt3可通過去乙酰化相關蛋白，增加ROS清除酶活性和穩(wěn)定線粒體功能，以減少ROS的生成、提高線粒體內ROS的清除作用，從而抑制線粒體內ROS的蓄積。并且Sirt3可以影響代謝相關的衰老性疾病如心臟疾病、癌癥等的發(fā)生。提示Sirt3可能通過抑制血管內皮細

4、胞線粒體內ROS的蓄積，影響AngⅡ誘導的血管內皮細胞衰老過程及內皮細胞功能。
　　目的：
　　1.探討Sirt3在AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老中的作用。
　　2.探討Sirt3對AngⅡ刺激的人臍靜脈內皮細胞功能的影響。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內皮細胞，購自美國ATCC公司。用ECM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2細胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、Sirt3-siRNA

5、組、AngⅡ組、Sirt3-siRNA+ AngⅡ組。
　　2.Sirt3-siRNA轉染
　　Sirt3-siRNA序列由試劑公司合成。用Western-blotting法篩選出抑制效率最高的一組抑制序列后，用LipofectamineTM2000轉染細胞，進行后續(xù)實驗。
　　3.Western blot
　　提取各組細胞總蛋白，Western blot法檢測各組細胞Sirt3、P16、P21、eNOS表達水平

6、。
　　4.各組細胞衰老情況檢測
　　通過β-半乳糖苷酶染色法檢測人臍靜脈內皮衰老情況。
　　5.各組細胞eNOS活性檢測
　　運用一氧化氮檢測試劑盒檢測各組細胞eNOS活性。
　　6.各組細胞上清總NO含量檢測
　　采用硝酸還原酶法檢測細胞上清總NO水平。
　　7.各組檢測ROS水平檢測
　　采用DCFH-DA法測定人臍靜脈內皮細胞內ROS水平。
　　8.統(tǒng)計學分析
　　采用

7、GraphPad Prism6統(tǒng)計學軟件進行數據分析，所有數據均以(x)±s表示，實驗組與對照組比較時采用t檢驗，多個實驗組比較時采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.Western blot顯示3條抑制序列中，抑制序列1Sirt3蛋白表達最少，抑制效率最高，故選擇序列1進行后續(xù)實驗。
　　2.Western blot顯示AngⅡ濃度為10-7，10-6，10-5 mol/L的三組細

8、胞Sirt3的表達量均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中10-6 mol/L組的Sirt3表達量最高。
　　3.Western blot顯示，與對照組相比，AngⅡ組P16、P21的表達量明顯升高，轉染Sirt3-siRNA后P16、P21表達量進一步升高。
　　4.β-半乳糖苷酶染色顯示AngⅡ組β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯高于對照組，轉染Sirt3-siRNA后β-半乳糖苷酶染色陽性率更高。
　　5.與對照組相比

9、，AngⅡ組細胞eNOS活性、細胞上清NO水平降低，而eNOS的蛋白表達增多。轉染Sirt3-siRNA后，eNOS活性、細胞上清NO水平進一步降低，eNOS的蛋白表達也減少了。
　　6.與對照相比，AngⅡ組細胞ROS水平明顯升高，轉染Sirt3-siRNA后細胞ROS水平進一步升高。
　　結論：
　　1.Sirt3可以延緩AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老的過程。
　　2.Sirt3對AngⅡ誘導的人臍靜脈內