力生長(zhǎng)因子通過(guò)PI3K-AKT途徑促進(jìn)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及其向成骨細(xì)胞的分化.pdf

1、第一部分兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)
　　目的：從兔身上得到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，為下一步試驗(yàn)提供研究材料奠定基礎(chǔ)。
　　方法：在無(wú)菌條件下從新西蘭大白兔體內(nèi)分離得到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)，并用免疫熒光法鑒定骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的CD44和CD34的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)MTT法得到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)代數(shù)。
　　結(jié)果：將分離好的rMSCs細(xì)胞在不同時(shí)進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的密度也在增加，并最終鋪滿(mǎn)整個(gè)底

2、部。CD44在rMSCs中有較高表達(dá)，而CD34在rMSCs中沒(méi)有表達(dá)。取P2，P3，P4， P5代細(xì)胞培養(yǎng)，用MTT法分別的其生長(zhǎng)的第1-10天檢測(cè)生長(zhǎng)情況。細(xì)胞在第4代時(shí)的生長(zhǎng)情況最好，明顯優(yōu)于其它三代細(xì)胞。
　　結(jié)論：從兔身上得到了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并得到其最佳的生長(zhǎng)代數(shù)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分力生長(zhǎng)因子通過(guò)PI3K/AKT途徑促進(jìn)rMSCs增殖及其向成骨細(xì)胞的分化
　　目的：研究力生長(zhǎng)因子（MGF）

3、通過(guò)PI3K/AKT途徑促進(jìn)rMSCs增殖及其向成骨細(xì)胞的分化的機(jī)制。
　　方法：通過(guò)MTT選出最佳的MGF濃度，進(jìn)而用Western blot觀察MGF對(duì)rMSCs中PI3K/AKT通路的作用，同時(shí)用定量PCR和Western blot觀察 rMSCs向成骨細(xì)胞分化的情況。
　　結(jié)果：MGF受體在MSCs中表達(dá)量較多，MGF的濃度為45ng/ml時(shí)作用第五天的效果最好。在4小時(shí)時(shí)磷酸化的 AKT和磷酸化的mTOR的表達(dá)量明

4、顯高于其他各個(gè)時(shí)間段。這表明MGF在作用四小時(shí)時(shí)的效果最佳。成骨細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白ALP和OCN在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量在四小時(shí)最高。
　　結(jié)論： MGF通過(guò)AKT促進(jìn)rMSCs增長(zhǎng)，及向成骨細(xì)胞的分化。
　　第三部分 PI3K/AKT磷酸化抑制劑LY294002對(duì)rMSCs增殖和分化的影響
　　目的：為進(jìn)一步研究 PI3K/Akt在 rMSCs中增殖作用，本研究用PI3K/Akt磷酸化抑制劑作用于rMSCs，研究其

5、對(duì)細(xì)胞的影響。
　　方法：用PI3K/Akt磷酸化抑制劑LY294002作用于rMSCs，用MTT法選擇最佳的作用濃度，用Western blot檢測(cè) LY294002磷酸化的AKT和磷酸化的mTOR的表達(dá)情況，用MTT檢測(cè)LY294002對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響，然后用western blot檢測(cè)檢測(cè)ALP和OCN的表達(dá)量。
　　結(jié)果：20μmol/L的 LY294002作用已經(jīng)較為明顯。對(duì)磷酸化的AKT和磷酸化的mTOR的表