復合成骨誘導劑促進大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:通過不同濃度的阿侖膦酸鈉(Alendronate，ALN)與相同濃度的常規(guī)成骨誘導劑（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/Lβ-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸）作用于大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(Bone Marrow StromalStem Cells，BMSCs)，研究ALN是否具有增強常規(guī)誘導劑誘導大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的作用，同時研究在何種濃度下增強效應最理想，以此來探討作為在骨組織工程中的種子細胞來源之一的BM

2、SCs如何在體外能高效的分化為成骨細胞，并觀察其成骨過程中BMP-2的表達，為以后臨床修復研究提供基礎性準備。
　　方法:取2只2月齡的雄性SD大鼠，將其脫頸處死消毒后在超凈工作臺內(nèi)解剖出四肢的股骨、脛骨并獲其骨髓，采用密度梯度離心法并結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠BMSCs，制備出BMSCs的單細胞懸液。接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，進一步去除未貼壁的干細胞及其他細胞等，待細胞貼壁達到培養(yǎng)瓶底80％

3、左右時，加入0.25％的胰蛋白酶進行消化傳代。取生長良好的第3代對數(shù)期細胞，以1×106/L的細胞濃度進行CD44，CD45表型鑒定以確定所得的細胞為骨髓基質(zhì)干細胞，同時繪制細胞生長曲線圖。將已進行鑒定的細胞以1×108/L的細胞濃度分為7個組分別為A-G，A組作為對照組，繼續(xù)加入含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng);B組加入含有常規(guī)誘導劑的培養(yǎng)基（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/Lβ-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸

4、）進行培養(yǎng);C組中加入含常規(guī)誘導劑及10-6mol/L ALN的培養(yǎng)基;D、E、F、G組分別在C組的基礎上將ALN的濃度分別改為10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L并加入，以上組均持續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，同時在倒置顯微鏡下觀察細胞的增殖及形態(tài)變化，培養(yǎng)1、2、3周后分別用western-blot法檢測細胞中BMP-2的表達并用t檢驗進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:用梯度離心法結(jié)合貼

5、壁法進行培養(yǎng)可以獲得高純度的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞。細胞在接種后48h出現(xiàn)貼壁，其形態(tài)出現(xiàn)多樣性如橢圓形、多角形以及短梭形;約72h后細胞則出現(xiàn)散在的紡錘狀并貼壁生長，10-14天后形成增殖。BMSCs貼壁早期排列較為疏松、紊亂，約3周后貼壁細胞變得致密。經(jīng)傳代培養(yǎng)后細胞得到進一步純化，其形態(tài)為均一的長梭形并呈漩渦狀排列，而且生長速率加快。生長曲線顯示:培養(yǎng)第4d起細胞呈對數(shù)生長，約第7d達到高峰，之后轉(zhuǎn)為平臺期。流式細胞儀檢測CD44陽性

6、表達率93.9％， CD45陽性表達率為5.5％。在加入不同濃度的單一或混合誘導劑后每周觀察發(fā)現(xiàn)各組細胞存活良好且E組中細胞變得肥大、多角，且周圍分泌物較其他組明顯增多，A組中細胞發(fā)生變化的數(shù)量最少，分泌物明顯最低，3個不同時期采用western-blot檢測發(fā)現(xiàn)BMP-2表達量順序均如下:E＞D＞F＞C＞G＞B＞A。
　　結(jié)論:本實驗結(jié)果表明:1.采用梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可以獲得純化的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞。2.ALN與常規(guī)誘導