胃癌中HMGA2通過SOX7調控上皮間質轉化和腫瘤細胞干性獲取的機制研究.pdf

1、目的：胃癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。近年來，隨著腫瘤綜合治療的開展，胃癌死亡率雖有所下降，但治療效果并無突破性進展，在國內其發(fā)病率和死亡率仍然位于各種惡性腫瘤的前列。目前認為，導致胃癌治療失敗、預后不佳乃至患者死亡的主要原因是腫瘤的浸潤和轉移，而癌細胞的侵襲和遷移是腫瘤轉移的關鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）與惡性腫瘤的浸潤轉移密切相關，也是近年

2、來探討腫瘤轉移的研究熱點。EMT是多細胞生物胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的一種常見現(xiàn)象。在EMT過程中，上皮細胞發(fā)生表型轉化，演變?yōu)轭愃瞥衫w維細胞的間質細胞表型，主要表現(xiàn)為上皮細胞極性消失，連接上皮細胞間緊密連接相關蛋白表達降低，細胞外基質(extracellular matrix, ECM)增多，細胞侵襲和抗凋亡能力增強；同時還可使腫瘤細胞獲得干細胞的特性，誘導腫瘤干細胞（tumor stem cells, TSCs）的發(fā)生，進一步促進腫瘤的侵

3、襲轉移。
　　高遷移率族蛋白A2（High mobility group protein A2，HMGA2）是一種非組蛋白染色體蛋白，作為一種結構轉錄因子，其本身缺乏轉錄活性，但是可以通過改變染色質結構來調節(jié)其他基因的轉錄，進而影響胚胎形成、組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生。HMGA2在分化成熟組織中低表達或不表達，而在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤組織中表達明顯上調。此外， HMGA2能通過干擾細胞周期而促使上皮細胞間質轉化及腫瘤細胞獲得干細胞特性，進而

4、維持腫瘤細胞的分化和自我更新能力。SOX7是含HMG domain的SOX轉錄因子家族SOX F亞族的一個成員。研究發(fā)現(xiàn)， SOX7基因的 C端存在轉錄激活結構域，作用機制主要由于該基因是Wnt/β-catenin信號通路的負性調節(jié)因子，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，使細胞的異常增生活動終止，從而發(fā)揮其腫瘤抑制的功能。
　　本課題前期研究使用染色質共沉淀加啟動子芯片方法（ChIP-on-chip），并通過 KEGG-

5、PATHWAY分析芯片結果，預測 SOX7可能是HMGA2通過Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞發(fā)生EMT的下游靶基因。本研究旨在從胃癌組織水平、體外細胞學檢測及裸鼠移植瘤體內驗證等方面，探討轉錄因子HMGA2通過SOX7調控胃癌細胞發(fā)生EMT和腫瘤細胞干性獲取的機制。
　　方法：（1）采用免疫組化SP法檢測158例胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達，分析兩者在胃癌組織中表達水平的相關性、兩者表達與臨床病理參數(shù)之間的

6、關系，以及對預后的影響；
　?。?）挑選合適的胃癌細胞株（MKN-28, SGC-7901和 MKN-45），構建過表達 HMGA2的慢病毒載體，轉染胃癌細胞 MKN-28和SGC-7901細胞，建立穩(wěn)定過表達 HMGA2的胃癌細胞株，并通過western-blot驗證干預效果；
　?。?）用免疫熒光和western-blot檢測過表達HMGA2前后胃癌細胞中干細胞標志物CD44和Oct4的表達，并通過Transwell、

7、BrdU和Wound Healing等方法進行過表達HMGA2前后胃癌細胞侵襲、增殖、遷移等功能學的檢測；
　?。?）通過免疫組化及 western-blot分別檢測胃癌組織中 HMGA2和 SOX7的表達，并分析二者表達的相關性；再從細胞水平檢測過表達HMGA2前后胃癌細胞中HMGA2和SOX7的表達情況；
　?。?）用生物信息學方法（UCSC軟件）分析并預測SOX7基因的啟動子區(qū)，然后構建 SOX7啟動子與 HMGA2作

8、用的熒光素酶（Luciferase）報告基因，進一步驗證二者是否存在作用關系；
　?。?）針對SOX7基因啟動子序列，設計合成SOX7-siRNA，用后者瞬時轉染內源性高表達 SOX7的 MKN28細胞株，并采用 qPCR和western-blot驗證轉染效果；
　　（7）通過western-blot檢測干擾SOX7前后EMT標志物E-cadherin, N-cadherin和Vimentin以及干細胞標志物CD44和Oct

9、4的表達情況，并進行相應的細胞功能學檢測；
　?。?）通過裸鼠移植瘤模型觀察胃癌細胞在干預SOX7前后的成瘤能力、生長情況和裸鼠生存時間，并通過免疫組化判斷胃癌細胞在干擾SOX7后是否在體內也能促進EMT和腫瘤細胞干性獲取，從而進一步說明SOX7是否是EMT和腫瘤細胞干性獲取的調控基因。
　　結果：（1）胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達成正相關，且二者表達與胃癌患者淋巴結轉移、血管入侵、肝轉移及臨床TNM分期有關。（2）

10、過表達HMGA2的慢病毒載體轉染內源性低表達HMGA2的胃癌細胞株MKN28和SGC-7901后可使其遷移、侵襲能力明顯增強，但增殖能力降低；干細胞標志物CD44和Oct4表達明顯升高。
　?。?）胃癌組織中HMGA2與SOX7的表達呈負相關；SOX7啟動子熒光素酶（Luciferase）報告基因發(fā)現(xiàn)HMGA2與其下游的SOX7存在作用關系，HMGA2過表達后可以明顯降低SOX7啟動子活性。
　?。?） SOX7-siRNA

11、干擾內源性高表達SOX7的MKN28細胞后， E-cadherin表達降低，N-cadherin、Vimentin、CD44及Oct4表達升高；同時細胞侵襲遷移能力增強，增值能力抑制；裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，使用SOX7-SiRNA干擾的MKN28細胞成瘤能力更強，但是移植瘤的生長速度減慢。
　　結論：HMGA2和Oct4在胃癌組織中高表達，且與腫瘤的浸潤轉移及患者的預后有關；穩(wěn)定過表達HMGA2及用SOX7-siRNA干擾胃癌細胞都