結(jié)腸癌相關(guān)基因KPNA2的篩選驗(yàn)證及其作用機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一，在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷增加，已成為最常見的惡性腫瘤。目前，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的功能異?？梢鸢┗蚣耙职┗虻霓D(zhuǎn)運(yùn)及定位功能異常，因此，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。
　　本課題聚焦于核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白家族，通過Real-time PCR篩選該家族內(nèi)與結(jié)腸癌相關(guān)的基因，經(jīng)過Western blot驗(yàn)證，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析包含203例樣品的結(jié)腸癌組織

2、芯片，通過構(gòu)建 vshRNA慢病毒載體抑制細(xì)胞中KPNA2的表達(dá)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評估KPNA2表達(dá)下調(diào)后對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：40例結(jié)腸癌樣品中，25例出現(xiàn)KPNA2的高表達(dá)，占總例數(shù)的62％；KPNA2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高達(dá)5倍以上的例數(shù)有18例，占總數(shù)的45%，提示KPNA2作為結(jié)腸癌相關(guān)基因的可能性大；Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，大多數(shù)結(jié)腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對應(yīng)的正常黏膜組織

3、。組織芯片中KPNA2基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常腸上皮組織，并且KPNA2基因的高表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立影響因素。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KPNA2基因的下調(diào)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移能力；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KPNA2基因的下調(diào)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力。
　　本實(shí)驗(yàn)研究KPNA2基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)模式及其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為KPNA2基因在臨床診斷和治療的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

4、　　第一部分，五個(gè)候選癌基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)
　　目的：檢測5個(gè)Karyopherins家族成員KPNA2、KPNA4、KPNA5、KPNA7及KPNB1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，以篩選該家族中與結(jié)腸癌相關(guān)的基因。
　　方法：Real-time PCR檢測40對結(jié)腸癌組織及其配對的正常黏膜組織中5種基因的mRNA表達(dá)水平，并通過Wsetern blot分析驗(yàn)證KPNA2在配對組織樣品中的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

5、>　　1.40例樣品中，25例出現(xiàn)KPNA2的高表達(dá)，占總例數(shù)的62%；16例出現(xiàn)KPNA4的高表達(dá)，占總例數(shù)的40%；10例表現(xiàn)出KPNA5高表達(dá)，占總例數(shù)的25%；KPNA7和KPNB1高表達(dá)的例數(shù)分別為13例和9例，各占總例數(shù)的32%和22%。此外，KPNA2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高達(dá)5倍以上的例數(shù)有18例，占總數(shù)的45%。2. Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示大多數(shù)結(jié)腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對應(yīng)的正常黏膜組織。

6、r>　　結(jié)論：KPNA2基因是在結(jié)腸癌中發(fā)揮主要作用的Karyopherins家族成員，其在結(jié)腸癌組織中的mRNA水平及蛋白水平均高于正常組織。
　　第二部分，結(jié)腸癌組織芯片中KPNA2的表達(dá)及預(yù)后判斷價(jià)值的研究
　　目的：免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測 KPNA2在結(jié)腸癌組織芯片中的表達(dá)，并分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法：免疫組織化學(xué)技術(shù)對203例結(jié)腸癌組織芯片進(jìn)行染色，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析KPNA2的表達(dá)與結(jié)腸

7、癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1. KPNA2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于其配對的正常黏膜組織，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；KPNA2基因的高表達(dá)與結(jié)腸癌的AJCC分期、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及Ki-67的表達(dá)顯著相關(guān)。
　　2. KPNA2基因高表達(dá)患者的5年無病生存率和總體生存率明顯低于KPNA2低表達(dá)患者；KPNA2基因的高表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立影響因素。
　　結(jié)論：

8、KPNA2基因是結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立診斷因素，可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　第三部分，KPNA2在結(jié)腸癌惡變進(jìn)程中的生物學(xué)功能研究
　　目的：構(gòu)建KPNA2表達(dá)水平下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型，以進(jìn)一步探討KPNA2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法：運(yùn)用vshRNA慢病毒載體抑制細(xì)胞中KPNA2基因的表達(dá)，構(gòu)建 RKO和HCT116兩種 KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株；通過 CCK-8、平板克隆、Transw

9、ell小室和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，研究KPNA2表達(dá)下調(diào)后對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建4個(gè) RNAi慢病毒載體候選靶點(diǎn)，并通過Real-time PCR和Western blot外源篩選出KPNA2-RNAi(23866-1)靶點(diǎn)對 KPNA2基因敲減效率最顯著，為有效靶點(diǎn)。
　　2. Real time PCR和Western blot驗(yàn)證由vshRNA慢病毒載體構(gòu)建的KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸

10、癌細(xì)胞中，KPNA2基因的敲減效率達(dá)70%以上，提示 KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　3.體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用CCK-8檢測各組細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48、72小時(shí)后，KPNA2基因敲減細(xì)胞的活性較其對照組明顯下降；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KPNA2基因敲減細(xì)胞的克隆形成能力較對照組明顯下降。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，KPNA2基因敲減組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組。
　　4.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) KPNA2