小鼠著床前胚胎特異ERV相關長非編碼RNA的定向篩選及功能研究.pdf

1、著床前胚胎發(fā)育是一個受到精密調控的發(fā)育過程。研究著床前胚胎發(fā)育機制對于生殖生物學及再生醫(yī)學都有深遠意義，因此著床前胚胎發(fā)育一直倍受矚目。在著床前胚胎發(fā)育過程中會發(fā)生一系列特異事件，如合子基因激活(zygote genome activation，ZGA)。長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)參與調控已經成為新的生物學研究領域。隨著測序技術的進步，大量lncRNA在早期胚胎中被發(fā)現(xiàn)，但是，目前還沒有研

2、究能夠回答有沒有一些lncRNA會參與到著床前胚胎發(fā)育調控過程中，如果有，這些lncRNA以怎樣的機制參與調控。內源逆轉錄病毒(Endogenous retroviruses，ERVs)是進化上內化于高等有顎脊椎動物基因組的逆轉錄病毒序列元件。內源逆轉錄病毒序列廣泛分布，占人類基因組的8％，占小鼠基因組的10％。內源逆轉錄病毒序列曾一度被認為是垃圾DNA，但越來越多的證據表明，內源逆轉錄病毒序列參與了多方面生物學調控。病毒序列編碼的蛋白

3、質可參與宿主細胞功能。有些內源逆轉錄病毒尚保持轉座能力，對于生殖細胞內基因重組等進化相關事件起到關鍵作用。我們早就知道小鼠ERV在著床前胚胎中轉錄，但具體發(fā)揮什么功能尚不清楚。是否存在ERV相關的lncRNA參與著床前胚胎發(fā)育調控值得研究。
　　我們針對ERVs的精心設計了半隨機引物，通過半隨機擴增，從小鼠早期胚胎各時期篩選mERV相關未知轉錄本，經過分子克隆技術（鏈特異性PCR及RACE等）獲得至少一個轉錄本全長，分析其是否為l

4、ncRNA。對明確是lncRNA的未知轉錄本進行亞細胞定位分析、表達模式分析以及功能研究。具體結果如下;通過PCR及測序結果的UCSC比對分析，我們鑒定出了36個新轉錄本。大部分新轉錄本(28/36)是ERV相關的，與預期相符。其中23個是GLN相關的，5個是MuERVL相關的;通過鏈特異性逆轉錄PCR以及RACE技術，我們發(fā)現(xiàn)lnc-GET是GLN，MERVL及MERVK相關的、可剪切的、有多聚腺苷酸尾的、含兩種剪切突變體的RNA;

5、Dyei是由GLN的LTR轉錄的、長665 nt的、GLN相關的、含3個外顯子的RNA。亞細胞定位分析表明lnc-GET和Dyei定位于核，且主要是染色質定位的，因此lnc-GET和Dyei是非編碼的。二級結構預測及miRNA反義Northern印記實驗排除了lnc-GET和Dyei是miRNA前體的可能性。TaqMan定量PCR實驗及RNA-FISH實驗表明，lnc-GET是2-至4-細胞胚胎特異表達的，Dyei是4-細胞胚胎特異表達

6、的;干擾lnc-GET導致胚胎發(fā)育阻滯于2-細胞時期，而干擾Dyei不影響著床前胚胎發(fā)育。干擾lnc-GET的胚胎在培養(yǎng)液中能維持2-細胞狀態(tài)至少4天而不凋亡。干擾lnc-GET阻滯的胚胎呈BrdU強陽性、CAF1陰性，表明阻滯于G2時期，呈H3第10位精氨酸磷酸化(H3S10ph)染色陽性，表明阻滯于G2晚期。γH2A.X免疫熒光染色呈陰性，表明阻滯不是由于DNA損傷導致的。阻滯胚胎內，G2/M轉換相關關鍵細胞周期蛋白依賴的蛋白酶CD

7、K1以及母源蛋白OCT4和CDX2沒有顯著變化;主要合子基因激活(major ZGA)起始不受影響。我們還發(fā)現(xiàn)臂間衛(wèi)星序列的正義鏈及反義鏈轉錄本表達水平沒有變化，DNA-FISH結果顯示臂間環(huán)已經變成了染色中心;通過低起始量RNA-seq我們比較了注射對照鎖核酸(LNA)的對照晚期2-細胞胚胎(2225枚)與干擾lnc-GET的阻滯2-細胞胚胎（2042枚）在majorZGA時期的基因表達情況?？傮w上講，在干擾lnc-GET的阻滯2-細

8、胞胚胎中有723個基因上調，521個基因下調(FDR≤0.0001，RPKM≥1，2倍以上)，多達11060個基因發(fā)生了異常剪切，表明干擾lnc-GET造成了majorZGA嚴重異常。KEGG通路分析表明干擾lnc-GET主要影響了MAPK信號通路，表現(xiàn)在ERK1/2-MAPK及LNK/p38-MAPK通路的核心因子表達量顯著下降。異常剪切基因的GO-BP分析結果表明發(fā)生異常剪切的基因主要聚類于細胞周期相關基因（主要是M周期相關的）。表

9、明干擾lnc-GET造成的阻滯可能是影響了細胞周期相關基因的轉錄及可變剪切導致的;我們通過pulldown-質譜來檢測lnc-GET結合的蛋白，鑒定出了hnRNP U、FUBP1、DAZAP1及ILF2。這4個蛋白定位于晚期2-細胞及早期4-細胞核內，說明是與lnc-GET共定位的。這4個蛋白都是剪切復合體組分，3個是轉錄因子，表明pulldown-質譜結果與RNA-seq結果相符:lnc-GET可能參與了轉錄及剪切調控;無論通過Wil