靈芝多糖的分離純化及抗乙肝病毒活性研究.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，它是一種藥用真菌，日常生活中出現(xiàn)的藥用靈芝一般為靈芝干燥子實(shí)體。靈芝在我國(guó)分布較廣，成分復(fù)雜，其在不同產(chǎn)地或不同的品種間成分含量不同，靈芝中活性成分主要為靈芝多糖和靈芝三萜類(lèi)化合物，具有突出的保肝解毒、安神、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、防治慢性支氣管炎等藥理活性。由靈芝制成的制劑、復(fù)方等常用于肝炎、肝纖維化、肝癌的臨床研究。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于靈芝抗乙肝病毒的研究主要集中于靈芝的

2、臨床應(yīng)用研究，而對(duì)于靈芝抗乙肝病毒的系統(tǒng)性的體外藥理實(shí)驗(yàn)研究較少，本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)染了乙肝病毒的HepG2.2.15乙肝細(xì)胞模型，通過(guò)跟蹤靈芝抗乙肝病毒的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了靈芝抗乙肝病毒的活性成分篩選，研究?jī)?nèi)容主要分為以下三個(gè)方面。
　　1.靈芝多糖的提取及其分離純化。根據(jù)提取靈芝醇提物、水提物抗乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（水提物效果較好），對(duì)靈芝水提物進(jìn)行濃縮、80％乙醇沉淀，得到靈芝多糖粗提物，含量為靈芝重量的2.8％。對(duì)靈芝多糖去蛋白脫色

3、后，對(duì)靈芝粗多糖分步醇沉，依次調(diào)整乙醇濃度，分別得到靈芝20％、40％、60％、80％醇沉多糖，根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)，60％醇沉多糖具有較好的抗乙肝病毒作用，故對(duì)60％分別經(jīng)DEAE纖維素離子交換柱和SephadexG-100萄聚糖凝膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，最后得到GLP-1和GLP-2這兩種主要成分，這兩種多糖通過(guò)凝膠柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法、高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示這兩種多糖均為均一多糖。
　　2.靈芝多糖的理化性質(zhì)

4、及其結(jié)構(gòu)初步探究。GLP-1為白色粉末，GLP-2淡黃色亮片狀固體，它們均易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。高效凝膠滲透色譜法測(cè)得GLP-1的分子量為95279Da，GLP-2的分子量為578096Da，對(duì)多糖進(jìn)行水解衍生化后，利用氣相色譜測(cè)其單糖組成，結(jié)果表明GLP-2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖這6種單糖，而GLP-1中不含有鼠李糖，GLP-1各單糖的摩爾比為1∶1.3∶3.0∶15.0∶2.6，GLP-2

5、中各單糖的摩爾比為:1.2∶2.2∶1∶3.8∶25.4∶1.3。紅外譜圖表明靈芝多糖GLP-1和GLP-2均含有多糖的特征吸收峰，其中GLP-2中可能含有呋喃糖苷。剛果紅實(shí)驗(yàn)表明GLP-1可能含有三股螺旋結(jié)構(gòu)，而GLP-2中不存在。
　　3.靈芝多糖體外抗乙肝病毒活性成分的篩選。以攜帶乙肝病毒的HepG2.2.15細(xì)胞為靈芝體外抗乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?shí)驗(yàn)分別以靈芝醇提物、水提物、20％、40％、60％、80％醇沉多糖、靈芝多糖G

6、LP-1和GLP-2作為供試藥，利用MTT法測(cè)細(xì)胞毒性，然后利用SPSS20.0計(jì)算TC50;利用ELISA法測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中抗原HBsAg和HBeAg含量，用SPSS20.0計(jì)算IC50，最后以TC50/IC50即TI值作為各供試藥的藥效評(píng)價(jià)指數(shù)。結(jié)果顯示，靈芝醇提物的對(duì)HBsAg和HBeAg兩種抗原的TI值分別為2.04和1.07，靈芝水提物對(duì)HBsAg和HBeAg兩種抗原的TI值分別為2.15和0.67，水提物的