轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)在UVC和順鉑誘導(dǎo)的SupF基因突變中作用機(jī)制的研究.pdf

1、本實驗的研究目的 綜合目前轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的研究進(jìn)展，本課題主要圍繞轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)在順鉑和UV導(dǎo)致的DNA損傷和突變過程中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，擬通過基因重組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、定標(biāo)性突變研究、藍(lán)白斑篩選、DNA測序等技術(shù)，在分子水平探討下面幾個問題：①在同一細(xì)胞內(nèi)如何實現(xiàn)GGR與TCR途徑單獨作用；②UV和順鉑造成的DNA損傷能否誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑的發(fā)生；⑨UV和順鉑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)過程中報告基因突變頻譜的特點；④轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑介導(dǎo)突

2、變發(fā)生的可能分子機(jī)制； 方法： 1.雙向啟動、雙報告基因的穿梭質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc構(gòu)建及鑒定 以Tet-on反應(yīng)質(zhì)粒pBI-L為載體，插入來源于質(zhì)粒pSupF-G1的突變報告基因SupF片斷，再設(shè)計一段引物，從質(zhì)粒pEGFP-1擴(kuò)增SV40ori/Kan/Neo片斷，合適的酶切處理后，與已經(jīng)亞克隆一次的載體質(zhì)粒連接，最終得到目的質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc，并通過酶切鑒定和測序分析等手段驗證插入

3、序列的位置和堿基順序的正確性，為下一步研究提供敏感、可靠的實驗工具。 2.Tet-on調(diào)控的SupFtRNA轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的建立和功能驗證 完整的Tet控制系統(tǒng)由Tet調(diào)節(jié)質(zhì)粒和Tet反應(yīng)質(zhì)粒構(gòu)成，Tet-on293細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Tet調(diào)節(jié)質(zhì)粒pTET-ON質(zhì)粒的人HEK293細(xì)胞，在本實驗中作為調(diào)節(jié)系統(tǒng)，已經(jīng)構(gòu)建并測序驗證后的pTCR-SupF-Luc為反應(yīng)系統(tǒng)。培養(yǎng)Tet-on293細(xì)胞，陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pTCR

4、-SupF-Luc瞬時轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞，8h后更換完全培養(yǎng)液，加入終濃度為1μg/ml的強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，48h后檢測Luciferase基因表達(dá)情況驗證轉(zhuǎn)錄是否得以進(jìn)行。裂解細(xì)胞，提取質(zhì)粒，純化后轉(zhuǎn)化專用菌SY204驗證SupF報告基因活性。 3.UVC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)與突變發(fā)生分子機(jī)制的研究 UVC(波長254nm的短波紫外線)體外損傷pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒，劑量為1500J/M2，

5、損傷后的質(zhì)粒陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞，細(xì)胞分為加藥組和對照組，8h后更換完全培養(yǎng)液，加藥組加入終濃度1μg/ml的DOX，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，使質(zhì)粒得以充分復(fù)制和修復(fù)。取部分細(xì)胞，裂解后測Luciferase基因表達(dá)情況，若明顯升高說明SupF報告基因轉(zhuǎn)錄已經(jīng)啟動，裂解剩余細(xì)胞，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化SY204細(xì)菌，通過藍(lán)白斑篩選挑取白色突變克隆，計算突變頻率=突變的白色菌落數(shù)/總菌落數(shù)。擴(kuò)增后測序獲得突變頻譜，分別對轉(zhuǎn)錄和

6、非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的突變情況進(jìn)行對比，分析UVC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)過程中突變產(chǎn)生的分子機(jī)制。 4.TCR在順鉑導(dǎo)致的SupF基因損傷和突變發(fā)生中的作用機(jī)制研究 pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒100μg，加入終濃度50uM的順鉑溶液，總體積200μl，室溫下放置4h，使質(zhì)粒充分染毒，形成DNA交聯(lián)。酚：氯仿抽提，無水乙醇沉淀得到純化質(zhì)粒，陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞，進(jìn)行定標(biāo)性突變研究，通過細(xì)菌的藍(lán)白斑篩選挑取突變

7、克隆確定突變頻率和DNA測序，分別測定轉(zhuǎn)錄與非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下SupF的突變特點，分析轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)在順鉑致突變過程中的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了雙向啟動、雙報告基因的穿梭質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc，經(jīng)過酶切鑒定和測序驗證，確定插入片斷的位置符合設(shè)計要求，堿基序列與來源序列同源性100％。 2.將Tet-on293細(xì)胞與pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒相結(jié)合，建立了Tet-on調(diào)控的SupFtRNA轉(zhuǎn)運系

8、統(tǒng)，經(jīng)過Luciferase基因檢測和SupF基因活性測定，證明了該系統(tǒng)的可控性和敏感性，本系統(tǒng)的具有以下特點：①SupF突變報告基因的轉(zhuǎn)錄可通過Tet-on系統(tǒng)精確調(diào)控；②雙報告基因：Luciferase基因、SupF基因，通過檢測Luciferase基因的表達(dá)可以明確SupF基因是否得以轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而明確是否誘發(fā)TCR途徑；③穿梭質(zhì)粒，pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒中含有原核細(xì)胞復(fù)制子ColE1和真核細(xì)胞復(fù)制子SV40ori，可以在細(xì)菌

9、和哺乳動物細(xì)胞中存活和復(fù)制，使得在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)生的遺傳學(xué)事件，能很方便地在細(xì)菌中得到報道；④SupF基因很小，遺傳背景清楚，通過DNA測序來定位突變熱點及上下游序列變得相對容易。 3.得到SupF突變報告基因由UVC誘導(dǎo)的在不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下的突變頻率和突變頻譜。TCR途徑，SupF基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，突變頻率為2.2％，突變熱點集中在5’-CG-3’、5’-CC-3’、5’-TC-3’區(qū)域；GGR途徑，SupF基因轉(zhuǎn)錄沉默，突變頻

10、率為1.2％，突變熱點集中在5’-GGGGGGG-3’、5’-CC-3’、5’-TT-3’區(qū)域。突變頻譜見下表所示。 4.得到順鉑誘導(dǎo)的SupF基因在不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下的突變頻率和突變頻譜，TCR途徑，SupF基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，突變頻率為1.45％，突變熱點集中在5’-CG-3’、5’-GCCG-3’區(qū)域；GGR途徑，SupF基因轉(zhuǎn)錄沉默，突變頻率為1.20％，突變熱點集中在5’-GGGGGGG-3’、5-GGGA-3’、5’-GAA

11、G-3’區(qū)域。突變頻譜見下表所示。 結(jié)論： 1.本研究成功構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)研究的雙向轉(zhuǎn)錄、雙報告基因的Tet-on反應(yīng)質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc。 2.本研究利用Tet-on293細(xì)胞和重組質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc組成可控的SupF報告基因定標(biāo)性突變研究系統(tǒng)，經(jīng)功能驗證符合理論預(yù)期，為研究轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)與突變發(fā)生的分子機(jī)制提供理想的實驗?zāi)Ｐ汀?3.在正常人類細(xì)胞內(nèi)報道了轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)參

12、與UVC和順鉑介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程。 4.UVC介導(dǎo)的CPDs損傷(環(huán)丁烷嘧啶二聚體)和順鉑導(dǎo)致的cis-1.3-d(GTG)鏈內(nèi)交聯(lián)主要由TCR優(yōu)先修復(fù)。 5.首次在SupF基因中確定了正常細(xì)胞TCR和GGR兩種修復(fù)狀態(tài)下突變頻譜的特征性差異。 6.通過對突變頻譜的分析發(fā)現(xiàn)，在UV和順鉑介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程中，TCR和GGR有著不同的“突變指紋”，提示TCR在修復(fù)兩種損傷過程中存在序列依賴性，兩種