PRAS40與14-3-3蛋白的分離純化及相互作用規(guī)律的酵母雙雜交檢測.pdf

1、2003年Grace Park 等人在利用14-3-3蛋白及Akt抗體篩選Akt作用底物時發(fā)現(xiàn)了一種新的由胰島素誘導(dǎo)出來的 14-3-3 結(jié)合蛋白PRAS40(Proline-rich-Akt Substate,40kDa)．DNA序列分析及純化的蛋白體外實驗表明，PRAS40是Akt直接作用的底物，且在人體內(nèi)的各個組織均有表達，尤其以心臟和肝臟內(nèi)表達量最高，該蛋白的序列分析表明他除了含有AKT磷酸化位點(Thr-246)外不含有任何其

2、他的可別辯識作用位點．然而他卻含有高達15％的脯氨酸(普通的蛋白脯氨酸的含量儀為5％)，這些脯氨酸結(jié)構(gòu)域是SH3 and/or WW 潛在的結(jié)合位點<,[2]>PRAS40 是一種新的發(fā)現(xiàn)于PI-3激酶信號通路中的蛋白．雖然它的基本功能尚不清楚，但因為它是Akt的作用底物且為14-3-3的結(jié)合蛋白，因此可以預(yù)見PRAS40在細胞的生命活動過程中一定起著十分重要的功能。 14-3-3蛋白于1967年首次在牛腦細胞中發(fā)現(xiàn)，它是一種

3、酸性的、可溶性異源二聚體蛋白，根據(jù)它們在淀粉凝膠中的遷移率命名為14-3-3，其大小約為23-28kD。研究表明它是一個有關(guān)連接蛋白和腳手架蛋白的蛋白家族，可以和60多種蛋白相互作用并在所有真核細胞表達，目前已鑒定出在真核細胞中表達的七個亞型。參于真核細胞中的蛋白激酶介導(dǎo)的信號通路，在基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)控、前體蛋白運輸中也起十分重要的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)它在治愈人類疾病，尤其是癌癥上也有著廣闊的前景。 利用 pDEST17-

4、14-3-3/BL21 及 Pdestl5-PRAS40/BL21 重組菌株，通過親和層析分離純化出了HIS融合的14-3-3七種亞型及GST融合的PRAS40蛋白。 為了初步鑒定PRAS40與14-3-3的相互作用規(guī)律，我們通過gateway技術(shù)，構(gòu)建了用于酵母雙雜交系統(tǒng)的質(zhì)粒pJG-PRAS40和pEG-PRAS40，同時通過酶切鑒定，證實成功構(gòu)建了pEG-PRAS40和pJG-PRAS40質(zhì)粒。將PRAS40和14-3-

5、3各亞型質(zhì)粒分別作為誘餌蛋白質(zhì)粒及轉(zhuǎn)錄激活質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞，通過β-半乳糖苷酶活性檢測以及氨基酸營養(yǎng)缺陷生長實驗分析它們之間的相互作用。酵母雙雜交實驗結(jié)果顯示PRAS40可以和14-3-3亞型tau，beta，zeta及epsiIon相結(jié)合，epsiIon較強，beta和zeta次之，tau較弱。 通過本實驗，初步鑒定了PRS40與14-3-3的相互作用規(guī)律，同時14-3-3和PRAS40蛋白的成功分離純化為進一步的弄清其相