特丁基對(duì)苯二酚對(duì)酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、長(zhǎng)年飲用過(guò)量酒精能夠引起心臟進(jìn)行性擴(kuò)大、并發(fā)各種心律失常和心力衰竭，以此為特征的心肌病變被稱為酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy，ACM)。在全世界范圍內(nèi)，酒精性心肌病的患病率都不斷上升，嚴(yán)重威害了人類的健康，并導(dǎo)致衛(wèi)生資源的巨大浪費(fèi)。ACM的發(fā)病機(jī)制有多種，氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡是其中兩個(gè)最重要的機(jī)制。酒精可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激又可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些誘導(dǎo)的損傷變化可以引起心肌細(xì)胞功能某些方面的改變，因此可

2、以導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙，最終降低心肌功能，造成酒精性心肌病。因此，研究一種能夠防治酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡的低毒且有效的藥物，對(duì)改善ACM預(yù)后有著非常深遠(yuǎn)的意義。
　　特丁基對(duì)苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)又名為特丁基氫醌，是一種安全有效的抗氧化劑，較其它抗氧化劑具有更為確切的抗氧化穩(wěn)定性。在神經(jīng)細(xì)胞及其他細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它具有抵抗氧化應(yīng)激損傷、對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)心血管系

3、統(tǒng)的作用研究還尚未有報(bào)道過(guò)。此外有研究表明特丁基對(duì)苯二酚可以保護(hù)顱神經(jīng)嵴細(xì)胞對(duì)抗酒精誘導(dǎo)的凋亡，在外周組織細(xì)胞如肝、腎等，tBHQ也具有保護(hù)作用。因此，我們很有理由去研究特丁基對(duì)苯二酚是否也能對(duì)心血管疾病中的氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用。
　　核NF-E2有關(guān)因子2(nuclear factorE2-related fator2，Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激中的中樞調(diào)控者。在轉(zhuǎn)錄正常情況下，Nrf2與Keapl（kelch-l

4、ike ECH-associated proteinl）相互結(jié)合，Nrf2的活性作用被Keapl所抑制，并錨定在細(xì)胞漿中，在激活情況下，Keapl和/或Nrf2的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致Nrf2和Keapl的綁定解除，Nrf2脫離了Keapl的束縛，之后轉(zhuǎn)入了細(xì)胞核，在Maf的參與下與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidantresponse element，ARE)序列結(jié)合，誘導(dǎo)與抵抗氧化應(yīng)激有關(guān)的酶基因表達(dá)。這些抗氧化酶能夠抵抗活性氧(rea

5、ctive oxygen species，ROS)及毒性物質(zhì)等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的侵害。研究還發(fā)現(xiàn)Keapl與凋亡相關(guān)蛋白FAC1、PGAM5、SQSTM1和p26均有關(guān)，Keapl還可與Bcl-2結(jié)合，使Bax表達(dá)增多，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Nrf2可以控制Keapl的轉(zhuǎn)錄而拮抗Keapl的作用，提示Nrf2信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡通路之間可能存在某種非常重要的聯(lián)系。由上可見，Nrf2細(xì)胞信號(hào)通路在保護(hù)細(xì)

6、胞免受氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活方面有著非常重要的意義。
　　目的:
　　為此本實(shí)驗(yàn)擬采用H9c2心肌細(xì)胞，建立酒精誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型。觀察了在離體細(xì)胞給予tBHQ治療后是否可以減輕酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并且分析了tBHQ抗心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，這種保護(hù)作用是否是部分通過(guò)激活抗氧化反應(yīng)通路Nrf2，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　方法:
　　1.以H9c2心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，設(shè)立

7、正常對(duì)照組;酒精組;tBHQ組;tBHQ+酒精組。濃度根據(jù)已有文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。
　　2.采用四唑鹽法檢測(cè)tBHQ對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響。
　　3.應(yīng)用凋亡檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。
　　4.采用活性氧檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平。
　　5.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察Nrf2的核轉(zhuǎn)位。
　　6.采用western blotting法檢測(cè)心肌細(xì)胞總-Nrf2、核

8、-Nrf2、SOD、catalase、HO-1、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　7.Nrf2 siRNA雙鏈寡核苷酸干擾細(xì)胞及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
　　8.利用(x)±s的表示方法呈現(xiàn)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入專用數(shù)據(jù)分析軟件spss13.0進(jìn)行科學(xué)分析，采用Student' s t-test和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，p＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.顯微鏡

9、下觀察細(xì)胞形態(tài)接種的心肌細(xì)胞24h后，絕大多數(shù)已經(jīng)貼壁良好，多呈梭形，細(xì)胞相互連接成網(wǎng);酒精組細(xì)胞變形明顯，漂浮細(xì)胞較多;tBHQ組細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)同對(duì)照組無(wú)明顯異常改變;tBHQ預(yù)處理明顯改善了酒精引起的細(xì)胞形態(tài)改變。
　　2.細(xì)胞存活率酒精以濃度依賴的方式導(dǎo)致細(xì)胞的存活率下降，200mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率下降更為明顯。不同濃度tBHQ(0，0.625，1.25，2.5，5，10，20，50 and100μmol/L)處理細(xì)

10、胞48h對(duì)細(xì)胞生存力無(wú)明顯影響。tBHQ預(yù)處理細(xì)胞明顯升高酒精所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率下降，并呈濃度依賴的方式，從1μmol/L開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10μmol/L與5μmol/L時(shí)比較生存率未明顯增強(qiáng)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以5μmol/L來(lái)研究tBHQ的保護(hù)作用。
　　3.細(xì)胞凋亡率AnnexinⅤ-FITC/PI檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率顯示200mmol/L的酒精可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，而tBHQ預(yù)處理細(xì)胞與酒精組相比明顯降低了細(xì)胞凋亡率。

11、r>　　4.ROS含量細(xì)胞內(nèi)ROS的含量可以cDCF的熒光強(qiáng)度表示，結(jié)果顯示200mmol/L的酒精可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而tBHQ預(yù)處理細(xì)胞與酒精組相比細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯下降。
　　5.免疫熒光分析酒精組明顯抑制了Nrf2的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位，而tBHQ預(yù)處理組與酒精組相比，明顯促進(jìn)了Nrf2的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。
　　6.Western blotting分析結(jié)果顯示酒精組Bcl-2蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少，而Bax表達(dá)較對(duì)

12、照組明顯增加，caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組也明顯增加，差異具有顯著性(p＜0.05)。而tBHQ預(yù)處理組提高了Bcl-2的表達(dá)，卻降低了Bax還有caspase-3蛋白的表達(dá)，與酒精組比較差異均有顯著性。與此相對(duì)應(yīng)，酒精組總-Nrf2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少(p＜0.05)。tBHQ預(yù)處理組可以明顯增加心肌細(xì)胞總-Nff2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表達(dá)

13、(P＜0.05)。
　　7.轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA結(jié)果顯示對(duì)照組及tBHQ藥物組轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA后，Nrf2及其下游的HO-1蛋白表達(dá)量均明顯降低。tBHQ預(yù)處理組可以明顯抑制酒精導(dǎo)致的caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)也可降低酒精導(dǎo)致的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加。而給予Nrf2 siRNA特異敲弱Nrf2的表達(dá)后，tBHQ預(yù)處理組的這種抑制凋亡蛋白表達(dá)和降低ROS含量的作用減低。
　　結(jié)論:
　　1.酒

14、精對(duì)H9c2心肌細(xì)胞以濃度依賴的方式導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低，200mmol/L酒精可明顯造成心肌細(xì)胞損傷，明顯降低細(xì)胞存活率。
　　2.200mmol/L酒精可明顯增加心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，明顯增加心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。
　　3.200mmol/L酒精明顯抑制了心肌細(xì)胞Nrf2表達(dá)、Nrf2核轉(zhuǎn)位和下游SOD、catalase、HO-1的表達(dá)，這可能與增加心肌細(xì)胞對(duì)酒精的敏感性有關(guān)。
　　4.tBHQ可能通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的R