骨骼肌特異性報告基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與驗證.pdf

1、目的：衛(wèi)星細胞(muscle satellite cells)認為是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的肌源性細胞。建立簡便快速的鑒定和篩選骨骼肌衛(wèi)星細胞的方法對于衛(wèi)星細胞培養(yǎng)、研究和應(yīng)用都具有實際的意義。Desmin是目前知道的表達開始于骨骼肌衛(wèi)星細胞并在肌纖維中高表達的標志蛋白。因此以Desmin基因的啟動子元件控制的報告基因可望建立鑒定和篩選骨骼肌衛(wèi)星細胞的簡便方法。本課題目的是構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒報告基因載體，特異性表達于骨骼肌細胞中

2、，并通過檢測其綠色熒光蛋白表達，驗證其在骨骼肌細胞中表達的特異性。并在此基礎(chǔ)上將本實驗所構(gòu)建重組載體制備成逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液，檢測其在分化的P 19細胞中的表達。 方法：(1)重組載體的構(gòu)建與鑒定，首先用PCR法擴增所需要的目的片段，綠色熒光蛋白和新霉素基因(GFP+NEO)和desmin啟動子和增強子(pro+enh)，然后利用限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，將目的基因連接到經(jīng)Nco Ⅰ，BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶

3、切后回收的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體psuper線性片段上。(2)重組載體的骨骼肌衛(wèi)星細胞表達特異性驗證：將psuper和重組載體分別轉(zhuǎn)染CHO和C2C12細胞，24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，采集圖片。(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液制備及其在分化P19細胞中的應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液轉(zhuǎn)染C2C12和DMSO誘導(dǎo)分化的P19細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，采集圖片。 結(jié)果：(1)通過對構(gòu)建過程的每一步進行電泳分析，證明了所

4、構(gòu)建重組載體是正確的。(2)重組載體和psuper轉(zhuǎn)染CHO和C2C12細胞后，在C2C12細胞表達水平相當(dāng)，說明重組載體在C2C12中能夠表達，而在CHO細胞中重組載體看不到表達，psuper則具有很高的表達。這就說明了重組載體具有骨骼肌衛(wèi)星細胞表達特異性。(3)制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液轉(zhuǎn)染C2C12后，綠色熒光表達效率有所提高但是并不非常明顯。在轉(zhuǎn)染了誘導(dǎo)分化的P19細胞中，發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的表達，據(jù)此可以定性判斷DMSO誘導(dǎo)P19細