PIG11基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其高表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建人PIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，建立高表達(dá)PIG11基因的HepG2細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PIG11基因在肝癌細(xì)胞中的功能及促凋亡作用提供一個(gè)理想的試驗(yàn)平臺(tái)。觀察PIG11基因高表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。 方法：將已有的pcDNA3.1/NT-GFP-PIG11質(zhì)粒用PCR法擴(kuò)增出PIG11片段，經(jīng)過酶切、T4 DNA聚合酶連接等步驟將該片段重組入pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，構(gòu)建含人PIG11 cDNA的重組質(zhì)粒pLX

2、SN-PIG11。重組載體經(jīng)PCR鑒定和DNA測(cè)序分析。將該重組質(zhì)粒用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，獲得pLXSN-PIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒液。用病毒液感染NIH3T3細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度。再用病毒液感染HepG2細(xì)胞，G418篩選，獲得PIG11高表達(dá)的HepG2細(xì)胞株。應(yīng)用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)經(jīng)感染后HepG2細(xì)胞的PIG11表達(dá)。對(duì)成功感染PIG11基因的HepG2細(xì)胞應(yīng)用HE染色、

3、DNA Ladder以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法測(cè)定PIG11在HepG2中高表達(dá)時(shí)對(duì)該細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pLXSN-PIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，測(cè)序證明PIG11cDNA編碼序列與GenBank中報(bào)道的一致。轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞后病毒釋放，經(jīng)檢驗(yàn)病毒滴度為1×105cfu/ml。用含病毒上清液感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)證實(shí)HepG2細(xì)胞中PIG11 mRNA及PIG11蛋白表達(dá)明顯

4、升高。高表達(dá)PIG11的HepG2細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上可觀察到凋亡細(xì)胞增多，有明顯的DNA Ladder條帶。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示感染PIG11的HepG2細(xì)胞凋亡率為41.13％±2.29％，明顯高于未處理組細(xì)胞的凋亡率3.33％±0.81％和感染空載體細(xì)胞的凋亡率3.53％±0.40％，且差異有顯著性（P<0.01）。 結(jié)論：成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-PIG11，獲得穩(wěn)定高表達(dá)PIG11蛋白的HepG2細(xì)胞株；PIG11蛋