hTERT-逆轉錄病毒載體構建及其介導的臍血間充質干細胞基因轉移研究.pdf

1、搜予單位代碼學號或申請?zhí)柮茌?0459020793公開鄭州大學碩士學位論文論文題目：作者姓名：學科門糞：專業(yè)名稱：導師姓名、職稱：hTERT逆轉錄病毒載體構建及其介導的臍血問充質干細胞基因轉移研究劉瑞敏醫(yī)學生理學邢瑩教授二零零五年五月十日塑型點堂!!墮手墮主蘭垡望文hTERT逆轉錄病毒載體構建及其介導的臍血問充廈干細胞基因轉移研究本實驗的目的是要構建hTERT逆轉錄病毒載體，在臍血MSCs原代培養(yǎng)和純化的基礎上導入hTERT基因，觀察該

2、基因對臍血MSCs細胞端粒酶活性的影響，是否能夠延長細胞的生命周期，并觀察轉基因細胞的分化能力。為進一步研究臍血MSCs的生物學特性及為組織工程學打下基礎。方法1采集健康正常分娩產婦志愿捐獻的臍血，用PBS(phosphatebufferedsalinePH74)進彳亍1：1稀釋，密度梯度離心分離單個核細胞(mononuclearcells，MNCs)，PBS洗滌2次后重懸于含15％胎牛血清的HlDMEM中，以110r／ml接種于50m

3、l培養(yǎng)瓶中，三天后換液，以后隔“sd全量換液。長至80％融合后用025％的胰酶和002％EDTA混合液消化后傳代。2用PCR法從質粒pEGFPhTERTCl擴出h11ERT的全部cDNA片斷，用DNA重組技術將hTERT基因定向克?。疦pLNCX2載體。3用陽離子脂質體介導法將病毒質粒導入包裝細胞內，用0418篩選出陽性產毒細胞克隆，測定病毒滴度。取陽性克隆的病毒上清感染臍血MSCs，篩選出轉基因細胞，我們將其命名為hTERTMSCs細

4、胞。采用反轉錄多聚酶鏈反應(reversetranscriptpolyrnemsechainreactionRT—PCR)方法檢測臍血MSCs轉染前后hTERT在mRNA水平的表達；采用端粒酶重復序列擴增法(telomererepeatamplificationprotocolassay，TRAP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELIsA)法檢測人臍位tMSCs轉染前后端粒酶活性的變化；采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)測轉染前后細胞生

5、長曲線，觀llTERT轉入后對細胞增殖的影響。4用5一氮雜胞苷罐J：hTERTMSCs向心肌方向誘導。用細胞免疫組織化學方法檢測心肌特異抗體：鼠抗人n橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體(鼠抗肌d—Sareomericactin)，兔抗人連接體43多克隆抗體(Connexin43)的表達。結果1用BglII和NotI雙酶切鑒定構建的質粒，酶切圖譜為61kb和36kb兩個片段，證明逆轉錄病毒載體PLNCX2hTERT構建成功。2用NIH3T3細胞檢測