乳腺癌細胞中CD74乙?；{控的分子機制.pdf

1、研究背景
　　癌癥又稱惡性腫瘤，是人類主要的致死疾病之一。作為女性中發(fā)病率最高的一類癌癥，乳腺癌使女性的健康受到了嚴重的威脅。而該疾病最主要的致死因素就是癌細胞的轉移擴散引起的多器官病變。因此，乳腺癌轉移機制的研究對其治療有著非常重要的意義。
　　CD74在人類中共有四種亞型:p33，p41，p35，p43，我們在乳腺癌中主要檢測到的是p35這一亞型。CD74可以發(fā)生多種翻譯后修飾，如N/O糖基化，磷酸化，棕櫚酰化;而CD7

2、4乙?；@一修飾還未見報道。CD74最初被發(fā)現(xiàn)是作為MHCⅡ的分子伴侶，在抗原遞呈中起重要作用。隨后發(fā)現(xiàn)CD74也具有不依賴MHCⅡ的功能，如作為細胞表面受體，即巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)的受體，引起信號級聯(lián)反應;調控樹突狀細胞遷移等。我們的前期數(shù)據(jù)表明，CD74調控乳腺癌細胞轉移，而乳腺癌細胞中CD74表達調控的分子機制并不清楚。
　　YB1(Y-Box binding protein1)在結構上分為多變非保守的N端結構域，

3、高度保守的冷休克結構域和C端結構域三部分。N端結構域含有豐富的丙氨酸和脯氨酸，與轉錄激活有關;C端結構域由酸性殘基和堿性殘基交替組成，與調節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用有關。YB1最初被發(fā)現(xiàn)是作為轉錄因子結合到MHCⅡ的啟動子區(qū)。YB1在DNA、mRNA和蛋白質多種水平上發(fā)揮作用，如參與DNA的修復、前體mRNA的剪切、維持mRNA的穩(wěn)定性以及蛋白與蛋白之間的相互作用等。前期工作中，我們利用軟件分析，發(fā)現(xiàn)在CD74的啟動子區(qū)以及CD74的m

4、RNA上都可能存在YB1的調控位點。因此，我們將重點研究YB1是如何調控CD74從而影響細胞轉移的，以期尋找到新的化療靶標。
　　研究方法
　　1.免疫印跡檢測YB1 siRNA干擾實驗對CD74及細胞運動相關蛋白表達的影響
　　2.RT-PCR實驗檢測YB1 siRNA干擾實驗在CD74轉錄水平的影響
　　3.免疫印跡檢測YB1 siRNA干擾實驗對CD74蛋白穩(wěn)定性的影響以及免疫共沉淀實驗探究YB1 siRN

5、A干擾實驗對CD74泛素化的影響
　　4.免疫共沉淀實驗探究CD74的乙酰化修飾以及質譜檢測CD74可能發(fā)生乙?；陌被嵛稽c
　　5.免疫共沉淀實驗探究YB1對CD74乙?；挠绊?br>　　6.免疫共沉淀實驗探究YB1和CD74以及其他相關蛋白之間的相互作用
　　7.免疫共沉淀實驗探究SIRT1對CD74乙酰化的影響
　　8.免疫共沉淀實驗探究三位點突變的CD74與YB1、SIRT1、CD44之間結合能力的改

6、變
　　9.Transwell實驗檢測CD74乙?；瘜毎忠u的影響
　　10.免疫共沉淀實驗探究CD74乙?；cCD74泛素化之間的關系
　　實驗結果
　　1.敲低YB1下調CD74和細胞運動相關蛋白的表達
　　2.YB1調控CD74的穩(wěn)定性是在蛋白水平上而非轉錄水平
　　3.CD74存在乙?；揎?，并且YB1影響CD74的乙酰化
　　4.CD74與YB1、SIRT1和HDAC1蛋白之間存在相

7、互作用
　　5.SIRT1影響CD74的乙?；?br>　　6.質譜分析CD74潛在的乙?；稽c分別是Lys80、Lys99和Lys106，將賴氨酸突變?yōu)榫彼岷驝D74的乙?；綔p弱，泛素化水平降低
　　7.CD74乙?；稽c突變影響CD74與YB1、SIRT1、CD44之間的結合
　　8.CD74乙酰化位點突變影響細胞侵襲
　　實驗結論
　　在人乳腺癌細胞中，我們發(fā)現(xiàn)YB1通過影響CD74與去乙酰化