腦膠質(zhì)瘤新生血管變化特征與動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　膠質(zhì)瘤是威脅人類健康的惡性程度較高的顱內(nèi)腫瘤，高級(jí)別膠質(zhì)瘤是新生血管最為豐富的惡性腫瘤之一。新生血管是腫瘤組織內(nèi)新生毛細(xì)血管產(chǎn)生、重塑，并形成相對(duì)成熟血管的過程，包括血管共生(Vascular co-option)、血管生成(Angiogenesis)、血管發(fā)生(Vasculogenesis)、馬賽克樣新生血管形成(Mosaic vessel formation)、血管擬態(tài)(Vascularmimicry)和膠質(zhì)

2、母細(xì)胞瘤內(nèi)皮轉(zhuǎn)分化(Glioblastoma-endothelial cell transdifferentiation)等類型。膠質(zhì)瘤新生血管的類型和數(shù)量在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中存在顯著的差異，不同類型的膠質(zhì)瘤新生血管對(duì)抗腫瘤藥物以及抗血管生成治療的敏感性不同，研究新生血管在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化特征對(duì)制定更加有效的抗腫瘤治療方案有積極的促進(jìn)作用。
　　磁共振成像(Magnetic resonance imaging)技術(shù)可以

3、無創(chuàng)的對(duì)活體組織進(jìn)行重復(fù)監(jiān)測(cè)，在腫瘤診斷、療效監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮重大作用。動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(Dynamiccontrast-enhanced MRI，DCE-MRI)可以描述血管通透性、有效灌注面積等生理狀態(tài)。目前已應(yīng)用于惡性程度的分級(jí)、療效監(jiān)測(cè)等方面，用于新生血管的評(píng)價(jià)尚無詳細(xì)的病理學(xué)及影像學(xué)的對(duì)照研究報(bào)道，其多參數(shù)的特點(diǎn)尚未得到完全有效的開發(fā)利用。膠質(zhì)瘤新生血管在組織學(xué)上無論是數(shù)量還是類型都具有較大的異質(zhì)性，新生血管對(duì)膠質(zhì)瘤的惡性

4、程度、患者的預(yù)后都有重要的影響，DCE-MRI可較好的評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤新生血管的功能狀態(tài)。
　　血管出芽、血管共生、血管套疊以及血管擬態(tài)等新生血管方式隨膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。MRI可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)新生血管及腫瘤細(xì)胞的生理、代謝等狀態(tài)，前期工作已經(jīng)證實(shí)Ktrans等參數(shù)與膠質(zhì)瘤微血管密度(Microvessel density，MVD)及腫瘤分級(jí)有較好的相關(guān)性，其與新生血管類型定量參數(shù)的相關(guān)性有待進(jìn)一步的證實(shí)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用

5、膠質(zhì)瘤原位模型研究膠質(zhì)瘤新生血管類型的存在形式及其動(dòng)態(tài)變化過程，同時(shí)探討DCE-MRI與新生血管組織學(xué)定量參數(shù)的相關(guān)性，為DCE-MRI顯示新生血管特征和動(dòng)態(tài)變化過程提供影像學(xué)與病理組織學(xué)相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法:
　　研究由膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型新生血管特征的組織學(xué)分析以及膠質(zhì)瘤新生血管特征與磁共振成像相關(guān)性研究?jī)刹糠纸M成。動(dòng)物模型采用三種常用的不同來源的膠質(zhì)瘤模型，分別為大鼠源性的C6膠質(zhì)瘤模型和人源性的U87、U25

6、1膠質(zhì)瘤模型。小動(dòng)物磁共振成像采用T2 WI以及DCE-MRI技術(shù)。
　　1.建立C6、U87、U251膠質(zhì)瘤原位模型:用量程為20μl的微量進(jìn)樣器吸取10μl膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，將注射器固定于腦立體定位儀上，垂直進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中，控制進(jìn)針深度為5mm，再回退1mm，手動(dòng)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液緩慢注入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，控制注射時(shí)間為10min左右。注射細(xì)胞懸液完畢后留針5min，骨蠟封口。
　　2.動(dòng)物生存狀態(tài)觀察:記錄每組荷瘤鼠的建模時(shí)間與死亡

7、日期，分析、比較荷瘤鼠生存率及半數(shù)生存期。
　　3.病理組織學(xué)觀察:
　　1) HE染色對(duì)腫瘤組織學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行觀察;
　　2) CD34、TNC、PAS-CD34免疫組織化學(xué)染色判斷并定量分析膠質(zhì)瘤模型新生血管的類型;
　　3)α-SMA、Desmin免疫組織化學(xué)染色研究膠質(zhì)瘤新生血管的成熟方式;
　　4) PCNA、MMP-2免疫組織化學(xué)染色比較不同類型新生血管對(duì)腫瘤增殖、侵襲能力的影響;
　　4.膠

8、質(zhì)瘤MRI動(dòng)態(tài)觀察
　　1)觀察6個(gè)時(shí)相點(diǎn)模型膠質(zhì)瘤的常規(guī)MRI表現(xiàn)及DCE-MRI特征:
　　2)測(cè)量6個(gè)時(shí)相點(diǎn)模型膠質(zhì)瘤DCE-MRI相關(guān)參數(shù)，包括Ktrans、Kep、Vp;
　　3)分析比較Ktrans、Kep、Vp值與新生血管類型組織學(xué)定量參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用(x)±s記錄。使用Kaplan-Meier法計(jì)算并繪制三種膠質(zhì)瘤模型

9、荷瘤鼠的生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較三組膠質(zhì)瘤模型的半數(shù)生存期。采用one-way ANOVA方差分析比較三種模型之間組織學(xué)定量參數(shù)的差異，Ktrans、Kep、Vp及組織學(xué)定量的組間差異，t-test比較數(shù)據(jù)的組內(nèi)差異。Spearman相關(guān)性分析比較MRI參數(shù)與新生血管類型定量參數(shù)的相關(guān)性并計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。規(guī)定P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、腦膠質(zhì)瘤原位模型新生血管組織學(xué)定量研究
　

10、　1.依照單盲實(shí)驗(yàn)的要求，經(jīng)兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立診斷，參考WHO2007年膠質(zhì)瘤分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，明確C6、U87、U251膠質(zhì)瘤模型分別對(duì)應(yīng)的人膠質(zhì)瘤WHOⅢ/Ⅳ的分級(jí)診斷。
　　2.生存分析顯示C6大鼠膠質(zhì)瘤模型半數(shù)生存期為30天，U87、U251人源性膠質(zhì)瘤模型的中位生存時(shí)間分別為50和53天。C6模型與其他兩種膠質(zhì)瘤模型的半數(shù)生存期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，U87、U251半數(shù)生存期不存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.三種膠質(zhì)瘤均具有較強(qiáng)

11、的增殖能力，PCNA指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.三種模型新生血管均異常豐富，MVD計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三種膠質(zhì)瘤模型新生血管的成熟存在兩種方式:一是α-SMA陽(yáng)性表達(dá)的血管周細(xì)胞的募集，二是Desmin陽(yáng)性的血管壁細(xì)胞的募集。U87、U251模型高表達(dá)α-SMA陽(yáng)性的血管周細(xì)胞，而C6模型則更多的募集Desmin陽(yáng)性的血管周細(xì)胞。
　　5.TNC染色觀察到三種模型中大部分腫瘤微血管通過血管出芽的方式新生。在模型生存終末期可以觀

12、察到部分腫瘤微血管存在血管套疊生成。HE染色配合CD34、GFAP免疫組織化學(xué)染色在膠質(zhì)瘤瘤旁組織鑒定出血管共生現(xiàn)象。CD34-PAS復(fù)染鑒定出膠質(zhì)瘤壞死周圍存在血管擬態(tài)這種特殊的新生血管類型。除血管擬態(tài)數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，三種模型之間血管出芽、血管套疊和血管共生均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　二、腦膠質(zhì)瘤新生血管動(dòng)態(tài)變化特征與MRI相關(guān)性研究
　　1.C6膠質(zhì)瘤病理表現(xiàn):大體標(biāo)本觀察到荷瘤鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)

13、“魚肉樣”新生腫塊組織，HE染色見腫塊組織異常豐富的新生血管以及特征性“柵欄樣壞死”，C6膠質(zhì)瘤組織侵潤(rùn)性生長(zhǎng)的區(qū)域?yàn)榫嗄[瘤邊緣約437.8±153.6μm的范圍。
　　2.膠質(zhì)瘤新生血管存在形式和動(dòng)態(tài)變化:移植細(xì)胞后第12和第16天血管共生現(xiàn)象最少，與其他四個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。6個(gè)時(shí)相點(diǎn)均顯示血管出芽生長(zhǎng)是C6膠質(zhì)瘤最重要的新生血管方式，不同時(shí)相點(diǎn)血管出芽定量有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。血管套疊為

14、在血管腔內(nèi)見到柱狀分隔，高倍鏡下觀察到血管套疊生長(zhǎng)的三個(gè)典型階段，即套疊式血管生成、套疊式血管擴(kuò)張和套疊式血管重塑。血管套疊僅在移植細(xì)胞第8天才出現(xiàn)，且隨腫瘤的增大而增多，不同時(shí)相點(diǎn)血管套疊數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，血管擬態(tài)數(shù)量較少，均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.膠質(zhì)瘤MRI動(dòng)態(tài)特點(diǎn):腫瘤體積隨移植推移而逐漸增大（P＜0.05）。腫瘤組織DCE-MRI灌注參數(shù)均隨著腫瘤生長(zhǎng)不斷升高（P＜0.05）。瘤旁組織Ktr

15、ans、Kep隨腫瘤生長(zhǎng)出現(xiàn)“先升高后下降”的變化規(guī)律（P＜0.05），Vp值的變化則無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.MRI參數(shù)與組織學(xué)參數(shù)的相關(guān)性:瘤旁組織DCE-MRI灌注參數(shù)Ktrans和Kep與C6膠質(zhì)瘤血管共生指數(shù)有較強(qiáng)負(fù)相關(guān)，Kep、Vp與套疊血管、血管出芽呈正相關(guān)(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.三種膠質(zhì)瘤原位模型中均存在四種新生血管類型，即血管出芽，血管共生，血管套疊以及血管擬態(tài)等，不