SSAT通過AKT-GSK-3β-β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲.pdf

1、背景：肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的最常見的死亡原因之一。通常情況下，肝癌患者早期沒有明顯癥狀，被診斷時多已發(fā)展到晚期階段，已不適合手術(shù)治療。因此，晚期肝癌治療方法的選擇受到了極大的限制。此外，由于術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高，肝癌患者的五年存活率仍然不能令人滿意。因此，認識肝癌轉(zhuǎn)移的作用機制對肝癌的治療具有非常重要的指導意義。多胺是一類在哺乳動物細胞中含量豐富，參與細胞生長、分化

2、等生理過程且發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物小分子，包括腐胺（Putrescine, PUT），亞精胺（Spermidine, SPD），以及精胺（Spermine, SPM）。已有大量文獻表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多胺的含量具有相關(guān)性。因此，多胺是一個十分有潛力的抗腫瘤靶點。精胺/亞精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）是真核細胞中多胺分解代謝的限速酶，是維持多胺濃度平衡的關(guān)鍵

3、酶。但是目前SSAT在肝癌中具體的生物學功能及作用機制仍然不清楚。
　　目的：以3種肝癌細胞（SMMC7721、Hep G2、Bel7402）為實驗對象，探討SSAT對肝癌細胞的影響及其分子機制。
　　方法：采用Western blotting實驗方法檢測3種肝癌細胞SMMC7721、Hep G2和Bel7402中 SSAT蛋白的表達情況；采用轉(zhuǎn)染的實驗方法構(gòu)建 SSAT穩(wěn)定高表達的 SMMC7721、Hep G2細胞株，以

4、及SSAT敲減的Bel7402細胞株；使用高效液相色譜法檢測SSAT對肝癌細胞內(nèi)多胺含量的影響；使用 MTT和克隆形成實驗方法檢測 SSAT對肝癌細胞增殖和克隆形成能力的影響；使用傷口愈合實驗和鋪有Matrigel的Chamber transwell實驗檢測SSAT對肝癌細胞的遷移和侵襲能力的影響；使用Western blotting實驗檢測AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化；使用高效液相色譜法檢測外加多胺對肝癌細胞

5、中多胺含量的改變，并使用Western blotting實驗檢測外加多胺是否影響AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化；LiCl抑制 GSK-3β后，使用鋪有 Matrigel的Chamber transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力，并使用Western blotting檢測β-catenin及下游蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：⑴Western blotting實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMMC7721、Hep G2中

6、SSAT表達含量較低，而Bel7402中較高。在此基礎(chǔ)上我們轉(zhuǎn)染并使用Western blotting驗證，成功構(gòu)建了SSAT高表達的SMMC7721、Hep G2細胞株，以及SSAT敲減的Bel7402細胞株。HPLC實驗發(fā)現(xiàn) SSAT高表達可以顯著下調(diào)肝癌細胞中多胺的含量。而 SSAT敲減后，多胺含量上升；⑵MTT和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn) SSAT可以顯著抑制肝癌細胞的增殖和克隆形成能力；⑶傷口愈合實驗和鋪有Matrigel的Chambe

7、r transwell實驗發(fā)現(xiàn)SSAT可以抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力；⑷Western blotting實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSAT表達增加，AKT表達降低，且磷酸化減少。GSK-3β磷酸化也降低。而 SSAT表達下降，結(jié)果相反；進一步實驗發(fā)現(xiàn) SSAT高表達，β-catenin、Cyclin D1、以及N-cadherin蛋白表達下調(diào)，而E-cadherin上調(diào)；⑸外源性多胺作用后，SSAT高表達的SMMC7721、Hep G2細胞中多胺含

8、量上升，基本與未轉(zhuǎn)染SSAT的空白對照中多胺含量相當。Western blotting檢測結(jié)果表明AKT、GSK-3β以及β-catenin蛋白水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；⑹GSK-3β抑制劑 LiCl作用后，SSAT對細胞的抑制侵襲作用明顯降低。Western blotting的結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin的蛋白水平隨著 p-GSK-3β的升高而上調(diào)。
　　結(jié)論：SSAT通過降低肝癌細胞中的多胺含量，經(jīng)由 AKT/GSK-3β/β-cateni