乙型肝炎病毒腫瘤蛋白細胞靶標HBXIP負向調控Toll樣受體信號轉導的機制研究.pdf

1、目的:
　　研究HBXIP在LPS誘導的TLR4信號轉導通路中發(fā)揮的作用;闡明HBXIP在TLR4轉運和降解過程中的重要作用及其機制。
　　方法:
　　1.構建pcmv-mHBXIP真核表達質粒，并測序鑒定。
　　2.定量PCR與Western blot的方法檢測HBXIP的表達規(guī)律，分析LPS刺激下HBXIP的表達變化。
　　3.以小鼠巨噬細胞系Raw264.7為細胞模型，建立HBXIP高表達和表達抑制的

2、穩(wěn)定轉染細胞系，用定量PCR和Western blot的方法鑒定HBXIP高表達和表達抑制的穩(wěn)定轉染細胞系。
　　4.用定量PCR和ELISA方法檢測HBXIP高表達的Raw264.7細胞系以及HBXIP表達抑制的Raw264.7細胞系中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等炎癥因子的表達情況;用Western blot的方法檢測LPS誘導下NF-κB信號通路以及MAPKs信號通路的變化（包括IKKα/β、IκBα、p65

3、、JNK、Erk、p38、IRF3等）。
　　5.通過免疫共沉淀的方法，檢測HBXIP和TLR4的直接作用;通過FACS分析巨噬細胞表面TLR4的表達變化;通過Western blot的方法檢測TLR4蛋白水平，用定量PCR檢測TLR4的轉錄水平變化。
　　6.通過Western blot的方法檢測HBXIP高表達的Raw264.7細胞系以及HBXIP表達抑制的Raw264.7細胞系中LC3Ⅱ的表達情況以及mTOR信號通路的

4、變化。
　　7.采用流式細胞術分析HBXIP對巨噬細胞溶酶體數(shù)量以及溶酶體pH的影響。
　　8.利用激光共聚焦，定位分析HBXIP高表達的Raw264.7細胞系以及HBXIP表達抑制的Raw264.7細胞系中TLR4與溶酶體以及自噬小體的共定位。
　　9.Western blot方法檢測HBXIP對巨噬細胞中轉錄因子EB(transcription factorEB，TEFB)的磷酸化水平的影響;利用激光共聚焦分析HB

5、XIP對TFEB核轉位的影響。
　　10.電鏡觀察HBXIP高表達和表達抑制的穩(wěn)定轉染細胞系中溶酶體的形態(tài)。
　　11.用TFEB siRNA，Rab7 siRNA，mTORC1的激動劑Cycloheximide(CHX)，溶酶體活性抑制劑Chloroquine diphosphate(CQ)，自噬溶酶體融合抑制劑Vinblastine處理巨噬細胞，Western blot方法檢測HBXIP對TLR4蛋白水平的影響。

6、　　結果:
　　1.HBXIP在LPS的刺激下呈現(xiàn)時間依賴性。
　　2.HBXIP能夠使IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎因子的表達顯著下調，HBXIP能減弱LPS誘導下NF-κB信號通路以及MAPKs信號通路的磷酸化。
　　3.HBXIP對TLR4的蛋白水平有靶向調控作用，HBXIP過表達能夠顯著抑制TLR4的蛋白表達。
　　4.HBXIP過表達能促進LC3Ⅱ的表達，抑制mTOR信號通路的相關蛋

7、白的表達水平，促進細胞自噬。
　　5.HBXIP過表達能減少TFEB的磷酸化水平，促進其核轉位，從而影響溶酶體的數(shù)量和功能。過表達HBXIP后，再用自噬溶酶體相關抑制劑處理，HBXIP對TLR4的下調作用消失。
　　結論:
　　HBXIP通過促進轉錄因子TFEB的活化，提高了溶酶體以及自噬溶酶體的活性，促進TLR4的內吞和降解，抑制了LPS誘導的IL-6，IL-1β，TNF-α以及IFN-β炎癥因子的分泌。我們認為HB