暫養(yǎng)海捕日本蟳“牛奶病”病原初步研究.pdf

1、近年來(lái)，舟山暫養(yǎng)的海捕日本蟳連續(xù)發(fā)生規(guī)模性死亡事件，病蟹的血淋巴液呈乳白色牛奶狀，與先前報(bào)道的梭子蟹“牛奶病”癥狀相似。為探索日本蟳“牛奶病”的病因，本論文從病理觀察、病原分離鑒定、免疫指標(biāo)檢測(cè)等方面對(duì)日本蟳“牛奶病”展開(kāi)研究，結(jié)果如下:
　　臨床癥狀和組織病理觀察:①發(fā)病的日本蟳攝食停止、行動(dòng)遲緩，打開(kāi)背部甲殼，血淋巴液由正常的藍(lán)青色變?yōu)榕Ｄ虪钊榘咨瑹o(wú)法正常凝固;②組織病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，病蟹的肝胰腺、鰓、肌肉和心肌組織都發(fā)生了

2、不同程度的病變，具體表現(xiàn)為:細(xì)胞腫脹、變性甚至壞死，部分細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解消失，基膜破裂，細(xì)胞界限模糊;③電鏡觀察:在病蟹的血淋巴液、肝胰腺、鰓、心臟等組織中均存在大量桿狀病毒，直徑大小約200-300nm，形狀類(lèi)似白斑病毒。將通過(guò)密度梯度離心從病蟹血淋巴液中分離提純到的病毒，電鏡負(fù)染也可見(jiàn)相似的桿狀病毒。
　　病原分離鑒定:①顯微觀察:未見(jiàn)明顯的寄生蟲(chóng)感染;②細(xì)菌分離:病蟹血淋巴液及肝胰腺在細(xì)菌培養(yǎng)板TSA及TCBS劃

3、線培養(yǎng)，未分離到優(yōu)勢(shì)菌群;③PCR檢測(cè):提取病蟹組織DNA樣本以及通過(guò)密度梯度離心獲得的純化病毒，用3對(duì)WSSV特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性;④Western Blot反應(yīng):將血淋巴液進(jìn)行PAGE電泳，用WSSV特異性抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，可見(jiàn)特異性的免疫條帶。⑤回感試驗(yàn):將病蟹血淋巴液處理后注射健康蟹，可導(dǎo)致健康蟹發(fā)病死亡，且死亡率與感染液濃度呈正相關(guān)，人工感染的病死蟹未復(fù)制出“牛奶”癥狀，但均可檢出WSSV。

4、
　　病蟹免疫指標(biāo)檢測(cè):對(duì)患病日本蟳與正常日本蟳肌肉組織和肝胰腺中的常規(guī)免疫指標(biāo)作檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病蟹肌肉中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性均比正常蟹高，而總抗氧化能力(T-AOC)的檢測(cè)結(jié)果則顯示，抽取的12個(gè)病蟹樣本中，有3個(gè)病蟹的T-AOC值較正常蟹低，其余9個(gè)病蟹的T-AOC值均高于正常蟹。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，病蟹體內(nèi)多種免疫相關(guān)酶活相比健康蟹均有不同程度的提高，證