家蠶核型多角體病毒BmNPV39k啟動子的分析與改造.pdf

1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟價值的昆蟲，為世界經(jīng)濟發(fā)展、文化傳播做出了重要貢獻。家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)感染家蠶引起的一種傳染性蠶病，給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大危害，提高家蠶品種對BmNPV的抗性是抗病育種的主要目標。近年來，轉(zhuǎn)基因RNA干涉技術(shù)興起，該技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因和RNAi的優(yōu)勢，有望成為培育家蠶抗病毒品種的有效途徑。利用強組成型啟動子能誘發(fā)

2、產(chǎn)生更多siRNA，提高RNAi效率，但是外源基因片段在組成型啟動子的驅(qū)動下，持續(xù)高量表達，不僅造成生物體內(nèi)資源的浪費，而且對生物體產(chǎn)生副作用，因此，只有在病源感染條件下才會驅(qū)動外源基因表達的誘導(dǎo)型啟動子逐漸成為研究熱點，在培育家蠶抗性新品種時，篩選一個高效合適的病毒誘導(dǎo)型啟動子顯得尤為重要。
　　 本研究的主要目的就是為家蠶轉(zhuǎn)基因RNA干涉BmNPV篩選一個高效的誘導(dǎo)型啟動子，為獲得家蠶抗BmNPV的轉(zhuǎn)基因素材奠定前期基礎(chǔ)。本

3、文對BmNPV誘導(dǎo)型啟動子進行了篩選，獲得了BmNPV誘導(dǎo)型啟動子，并對其進行改造，構(gòu)建了基于該啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因干涉載體。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、BmNPV啟動子的選擇與克隆
　　 根據(jù)文獻報道和桿狀病毒的級聯(lián)調(diào)控特征，參照BmNPV基因功能，初步確定了Bm122、Bm21、P143、39k、P33、VP1054、P6.9這7個病毒基因的啟動子作為篩選病毒誘導(dǎo)型啟動子的對象。根據(jù)NCBI公布的BmNPV（T3株）

4、基因組序列，分析并克隆了7個基因ATG上游800-1000bp區(qū)域作為啟動子序列，成功構(gòu)建螢火蟲熒光素酶重組質(zhì)粒PGL3-Bm122，PGL3-Bm21，PGL3-P143，PGL3-39k，PGL3-P33，PGL3-VP1054，PGL3-P6.9。重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒P-IE1-Rlucp共轉(zhuǎn)染家蠶BmN-SWU1細胞，運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，分析啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示:與未感染組相比，BmNPV感染72h后，上述7個基

5、因啟動子的熒光素酶相對比值均有不同程度的上調(diào)，表明BmNPV感染能提高上述啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，其中39k啟動子感染前后提高了71.9倍，啟動子的病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性在上述啟動子中最高。由此，將39k啟動子作為進一步研究的對象。
　　 2、39k啟動子的序列特征與功能分析
　　 對39k啟動子進行序列分析，發(fā)現(xiàn)其序列中含有增強子類似元件[檢索模式為A（A/T）CGT(G/T)，即CGTGC]、加帽位點（CAGT-motif，是立

6、即早期、延遲早期基因必須的特征性序列）和TATA盒基元序列，符合真核生物啟動子特點。
　　 采用PCR法對39k啟動子5'端UTR進行分段缺失，構(gòu)建缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細胞，測定BmNPV感染后24h、48h、72h相對酶活，確定了39k啟動子轉(zhuǎn)錄活性最高的區(qū)段是克隆的全長啟動子序列，對轉(zhuǎn)錄活性起至關(guān)重要的區(qū)段位于TSS(Transcription Start Site)上游-610～-419bp處;39k啟動子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)

7、錄活性區(qū)域位于TSS上游-419至TSS下游31bp處。
　　 將全長39k啟動子質(zhì)粒PGL3-773luc轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細胞，測定BmNPV感染后24h、48h、72h相對酶活，探討39k啟動子的轉(zhuǎn)錄時相。結(jié)果表明，在病毒感染24h及以后的各時間點，39k啟動子活性逐漸提高，72h達到最大，72h與24h相比，相對酶活差異極其顯著(P＜0.01)，與48h相比，相對酶活有顯著性差異(P＜0.05)，這符合39k基因是延遲

8、早期基因的特點，并且39k啟動子的轉(zhuǎn)錄活性在感染BmNPV后24h～72h內(nèi)具有時間累積效應(yīng)。
　　 3、39k啟動子的改造
　　 桿狀病毒的同源重復(fù)區(qū)hr(homologous regions，hrs)是一種普遍使用的增強元件，桿狀病毒多角體上游基因polh-up(pu)被證實同樣能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄。將BmNPV來源的hr3、hr5、polh-up(pu)、hr3-pu克隆至39k全長啟動子上游，以Bmactin基因啟

9、動子A4啟動子作為陽性對照，分析各個增強元件的增強效果。瞬時轉(zhuǎn)染實驗表明:無BmNPV感染時，39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k啟動子轉(zhuǎn)錄活性極低;BmNPV感染后，39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k啟動子熒光素酶相對比值不同程度地上調(diào)，具有BmNPV誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性;hr3的增強效果要強于pu、hr5，與39k啟動子相比，相對酶活提高了4.38倍;hr3和pu

10、共同作用，增強作用更加明顯，與39k啟動子相比，酶活提高了14.3倍;與組成型強啟動子A4相比，相對酶活提高了2.147倍。上述結(jié)果表明polh和hr3聯(lián)合作用，能夠顯著提升BmNPV39k啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時，上述39k啟動子驅(qū)動DsRed達，轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細胞，DsRed發(fā)光情況與熒光素酶活性分析的結(jié)果一致。由此確定hr3-polh的增強作用最強，hr3-polh-39k啟動子將用于后續(xù)RNAi研究。
　　 4、

11、細胞水平檢測39k啟動子shRNA干涉效果
　　 為了檢測hr3-pu-39k啟動子能否在家蠶細胞水平驅(qū)動shRNA轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)RNA干涉，從而實現(xiàn)特異性的基因沉默，設(shè)計合成3條特異性針對BmNPVlef-1基因的特異性靶標序列，由hr3-pu-39k啟動子驅(qū)動，分別構(gòu)建PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA干涉載體和PGL3-A4-luc-lef-1表達載體。
　　 PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA

12、、PGL3-A4-luc-lef-1和內(nèi)參質(zhì)粒P-1E1-Rlucp共轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細胞，感染后72h收集細胞，檢測熒光素酶活性。BmNPV感染后72h，實驗組（PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA）的熒光素酶相對比值與對照組相比，明顯下降。實驗組感染前后，相對酶活差異性極其顯著(P＜0.01)，干擾序列能在mRNA水平抑制lef-1基因的表達，抑制效果高達85％以上，表明在細胞水平，BmNPV能夠誘導(dǎo)39k啟動子驅(qū)動s