家蠶核型多角體病毒ORF75基因的克隆及表達(dá).pdf

1、根據(jù)GenBank發(fā)表的序列(L33180)設(shè)計(jì)引物，以家蠶核型多角體病毒為材料，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了編碼家蠶核型多角體病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段，將其克隆至pMD18-Tvector上，獲得了該基因成熟蛋白閱讀框序列。利用設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)將目的基因從T載體上切下。目的片斷和表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切，連接得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX/

2、Bm75。將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX/Bm75轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析表明產(chǎn)生57kDa左右的特異蛋白質(zhì)條帶。為了進(jìn)一步檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物是不是含有與GST融合的蛋白，以MouseAnti-GST為第一抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblotting分析，結(jié)果表明，pGEX/Bm75經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的57kDa蛋白條帶與抗體發(fā)生了很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，表明融合蛋白得到了

3、表達(dá)。該融合蛋白含有一個(gè)GST，可以在對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析的同時(shí)，結(jié)合相應(yīng)的蛋白酶切割實(shí)現(xiàn)目的蛋白的純化。 本實(shí)驗(yàn)并對(duì)家蠶核型多角體病毒ORF75基因核苷酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，BmNPVORF75基因位于70485bp和71264bp之間，編碼一個(gè)259個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)分子量為30.8kDa,等電點(diǎn)為7.67，分子式為C1409H2157N351O390S19；蛋白在大腸桿菌內(nèi)的半衰期大于10個(gè)小時(shí)；酸性氨基酸(

4、Asp+Glu)占10.5％，堿性氨基酸(Arg+Lys)占10.8％；蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為42.67，是不穩(wěn)定蛋白。對(duì)Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)掃描，查到4類9個(gè)蛋白修飾位點(diǎn)。通過Blast搜索氨基酸同源序列發(fā)現(xiàn)，Bm75同源蛋白存在于所有測(cè)序的鱗翅目桿狀病毒，不存在于其他非鱗翅目昆蟲桿狀病毒中。這表明，Bm75同源蛋白可能是鱗翅目桿狀病毒所特有的。從同源序列比對(duì)的結(jié)果來看，Bm75蛋白的氨基酸序列與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autogra