棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒（HaSNPV）orf44基因的研究.pdf

1、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HaSNPV)是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其分子生物學和基因功能研究己取得很大進展。開放閱讀框44(open reading frame 44,orf44)是HaSNPV的一個功能未知的結構基因，本文首次對HaSNPV G4株基因組中的orf44基因進行研究報道。 orf44基因

2、和Ha44蛋白序列通過生物信息學分析表明：orf44基因長1137bp，預計編碼378個氨基酸，預測蛋白質分子大小為42KDa；orf44基因起始密碼子上游．80和-88位分別存在晚期啟動子信號TAAG和早期啟動子信號TATA；基因沒有明確的功能結構域；通過PSI-BLAST比對發(fā)現(xiàn)，Ha44有多種桿狀病毒同源蛋白，這些蛋白存在于group Ⅱ NPV或顆粒體病毒屬((7rranulovirus，GV)中，其相應的功能還未知。

3、 本試驗中，我們用表達載體pGEX-KG及表達宿主大腸桿菌BL21對orf44基因進行谷胱甘肽(GST)融合表達，表達產物約為68KDa，與預期的大小相符。表達蛋白經初步純化(包涵體純化和凝膠電泳分離相結合)，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。經ELISA和western-blot檢測，獲得了特異性較強的抗體，為進一步D壚4基因的表達時相分析作準備。 我們利用熒光蛋白基因egfp作為報告基因，將orf44和orf44連接在真核表達

4、載體pIZ/V5-His上，形成融合表達產物，轉染美洲棉鈴蟲細胞HzMA1，觀察GFP在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下綠色熒光的分布位置，將orf44基因表達產物Ha44定位于細胞核，這表明該蛋白可能是病毒的重要結構基因，參與病毒基因復制與增殖。 為研究orf44基因的功能，我們通過同源重組在原核水平將該基因敲除，構建orf44基因缺失型重組病毒。即設計一對70bp，含有orf44基因同源臂的引物，以PCR的方法合成可供同源