兩種泥鰍SoxE亞族和DMRT1基因的結(jié)構(gòu)與功能分析.pdf

1、本文利用RACE方法克隆得到了兩種泥鰍SoxE亞族全部成員基因和大鱗副泥鰍DMRT1基因,并利用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR對各個基因的表達模式進行了研究,為了更進一步確定目的基因的表達部位,我們利用RNA原位雜交法分別對兩種泥鰍的性腺和不同發(fā)育時期的胚胎進行了雜交,主要研究結(jié)果包括下面三個方面:
　　 1.泥鰍SoxE亞族基因的克隆和表達模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種Sox8和Sox10基因HMG保守區(qū)

2、序列,設(shè)計兩對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法從泥鰍腦中分離得到了SoxE亞族各成員cDNA全序列:MaSox8a基因cDNA全長為2555bp,包括53bp5'非翻譯區(qū),1212bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼429個氨基酸的開放閱讀框(基因注冊號為GU166139);MaSox8b基因cDNA全長為1725bp,包括85bp5'非翻譯區(qū),395bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼414個氨基酸的開放閱讀框(基因注冊號為

3、GU166140);MaSox9a基因cDNA全長為3192bp,包括326bp5'非翻譯區(qū),1408bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼485個氨基酸的開放閱讀框;MaSox9b基因的cDNA全長為1782bp,包括217bp5'非翻譯區(qū),179bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼462個氨基酸的開放閱讀框;MaSox10基因的cDNA全長為2096bp,包括311bp5'非翻譯區(qū),312bpY非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼490

4、個氨基酸的開放閱讀框。
　　 半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示:在泥鰍胚胎發(fā)育的各個時期,MaSox8a和MaSox8b的表達趨勢相反但是都從原腸胚開始一直持續(xù)到卵黃吸盡期,MaSox9a和MaSox9b的表達量都逐漸升高,在孵出期期表達量最高,MaSox10的表達量逐漸增加,孵出期達到最高;在泥鰍成體的不同組織中,SoxE亞族各個基因都廣泛存在,MaSox8a和MaSox8b在腦中的表達量較高,MaSox9a和

5、MaSox9b在性腺中表達量最高,Sox10在心臟中表達量最高。
　　 原位雜交試驗結(jié)果顯示:SoxE亞族的五個成員都在泥鰍未成熟的生殖細胞(卵巢的卵原細胞、初級卵母細胞,精巢中的精原細胞和精母細胞)中表達,因此推測SoxE亞族的五個成員可能調(diào)控泥鰍性腺的發(fā)育和分化;整體胚胎雜交發(fā)現(xiàn),SoxE亞族的五個成員均在體節(jié)形成期的體節(jié)中大量表達,之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很強的陽性雜交信號,孵出期以后SoxE亞族的五個成員的表達主

6、要集中在泥鰍的脊柱、體節(jié)和頭部。
　　 2.大鱗副泥鰍SoxE亞族基因的克隆和表達模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種Sox8和Sox10基因HMG保守區(qū)序列,設(shè)計兩對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法從泥鰍腦中分離得到了SoxE亞族各成員cDNA全序列:PdSox8a基因cDNA全長為2467bp,包括53bp5'非翻譯區(qū),1127bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼428個氨基酸的開放閱讀框;PdSox8b基因c

7、DNA全長為2166bp,包括201bp5'非翻譯區(qū),720bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼414個氨基酸的開放閱讀框;PdSox9a基因cDNA全長為3232bp,包括329bp5'非翻譯區(qū),1439bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼487個氨基酸的開放閱讀框;PdSox9b基因的cDNA全長為1946bp,包括219bp5'非翻譯區(qū),341bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼461個氨基酸的開放閱讀框;PdSox10基因

8、的cDNA全長為2053bp,包括312bp5'非翻譯區(qū),262bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼492個氨基酸的開放閱讀框。
　　 半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示:在大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育的各個時期,PdSox8a、PdSox8b、PdSox9b和PdSox10的表達量都逐漸下降,PdSox9a的表達量則相反呈現(xiàn)上升趨勢;在大鱗副泥鰍成體的不同組織中,SoxE亞族各個基因中廣泛存在,并且都在性腺中大量表達,除

9、此之外PdSox8a在腦中的表達量也很高,PdSox8b、PdSox9a和PdSox9b在肝中的表達量均較高,PdSox10在心臟中表達量高。
　　 SoxE亞族的五個成員在大鱗副泥鰍性腺和胚胎中的原位雜交試驗結(jié)果與泥鰍的一致。
　　 3.大鱗副泥鰍DMRT1基因的選擇性剪接和時空表達模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種DMRT1基因DM保守區(qū)序列,設(shè)計一對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法獲得了大鱗副泥鰍DM

10、RT1基因的cDNA全長。結(jié)果表明:在大鱗副泥鰍中DMRT1基因存在選擇性剪接。大鱗副泥鰍中得到五條DMRT1基因,分別命名為PdDMRTla1(1903bp)、PdDMRTla2(1714bp)、PdDMRTla3(887bp)、PdDMRTlb(724bp)和PdDMRTlc(946bp),它們也都含有DM基序和polyA尾。其中PdDMRTla1～3具有相同的開放閱讀框,包含5個完整的外顯子,編碼267個氨基酸,其差異主要在于3'

11、非翻譯區(qū)長度和序列不同;PdDMRTlb缺失了第四個外顯子3'末端的9bp和第五個外顯子,編碼220個氨基酸;PdDMRTlc則同時缺失了第四和第五個外顯子,并利用一段長63bp的額外序列在其編碼框末端充當?shù)谖鍌€外顯子,編碼196個氨基酸。
　　 半定量RT-PCR、熒光定量RT-PCR和原位雜交技術(shù)用于檢測大鱗副泥鰍DMRT1基因在成體不同組織和胚胎發(fā)育不同時期的表達譜。結(jié)果表明:大鱗副泥鰍DMRT1基因只在精巢中強烈表達,而

12、在卵巢中不表達或只有極微弱表達,這與其它物種中的研究結(jié)果相一致;在胚胎發(fā)育的各個時期大鱗副泥鰍DMRT1基因均有表達,但表達強度又各不相同,呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢。由此,推斷大鱗副泥鰍的DMRT1與雄性性腺分化和發(fā)育具有明顯的相關(guān)性。這些結(jié)果為闡述DMRT1在脊椎動物體內(nèi)對性別決定和性別分化的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述本研究結(jié)果證明:1.兩種泥鰍SoxE亞族至少由五個成員組成:Sox8a、Sox8b、Sox9a、Sox

13、9b和Sox10;2.本實驗首次發(fā)現(xiàn)在兩種泥鰍中Sox8基因都具有兩個亞型Sox8a和Sox8b,目前僅發(fā)現(xiàn)河豚Sox8基因具有以上兩種亞型,其它物種中未見到相關(guān)報道;3.兩種泥鰍中Sox9基因也都具有兩個拷貝Sox9a和Sox9b,而Sox10基因只存在一個拷貝,這與部分己報道的物種一致;4.我們發(fā)現(xiàn)大鱗副泥鰍的DMRT1基因存在選擇性剪接;5.本實驗首次利用多種檢測方法對各個目的基因的表達模式進行了系統(tǒng)研究。SoxE亞族各成員之間存