PLGA-TCP快速成型支架復合rhBMP-2殼聚糖微球修復兔股骨髁部骨缺損的實驗研究.pdf

1、骨缺損的修復在臨床治療中是一大難題，目前尚未取得最好地解決辦法。近年來組織工程的快速發(fā)展，將成為骨缺損修復治療的新方法，但組織工程人工骨用于骨缺損的治療時有一個必需克服關鍵性的問題，即人工骨的骨誘導活性問題。rhBMP-2是在促進新骨形成及塑型過程中起重要作用的細胞因子，本研究使用殼聚糖將這個具有高效促新骨形成能力的細胞因子，采用乳化交聯(lián)的方法制備成rhBMP-2殼聚糖緩釋微球用纖維蛋白膠與PLGA/TCP材料復合，構(gòu)建新型的具有緩釋功

2、能的組織工程化人工骨，以期通過組織工程人工骨治療骨缺損時能快速促進新骨形成，進而有效修復骨缺損。
　　1.rhBMP-2殼聚糖微球的制備及體外檢測
　　目的：以殼聚糖為輔料，通過乳化交聯(lián)法制備新型的rhBMP-2緩釋微球，并對其粒徑、載藥、體外釋藥、理化特性及降解特性進行檢測，以評估應用生物可降解的殼聚糖微球作為rhBMP-2緩釋載體的可行性。方法：以京尼平作為交聯(lián)劑，應用乳化交聯(lián)法制備具有控制釋放功能的負載rhBMP-2的

3、殼聚糖微球，應用掃描電鏡觀察微球的形態(tài)和粒徑；利用酶聯(lián)免疫吸附的方法(ELISA)動態(tài)檢測rhBMP-2殼聚糖微球的藥物載藥率、包封率和緩釋規(guī)律以分析微球的緩釋能力。結(jié)果：乳化交聯(lián)法制備的殼聚糖微球，球形良好，球體表面光滑，具有較高的包封效率（>85％）。體外藥物釋放試驗表明，rhBMP-2可以從殼聚糖微球中緩慢釋放，整個釋放過程可達30天。結(jié)論：應用乳化交聯(lián)法制備的負載rhBMP-2殼聚糖緩釋微球，具有很好的控制釋放rhBMP-2的能

4、力。這種新型藥物控制釋放系統(tǒng)在細胞因子的控制釋放及骨組織工程中有潛在的應用價值。
　　2.rhBMP-2殼聚糖微球體外相容性及誘導成骨能力的檢測
　　目的:觀察殼聚糖微球與體外培養(yǎng)條件下兔骨髓基質(zhì)干細胞生物性相容性。評估rhBMP-2殼聚糖緩釋微球誘導兔骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的能力。方法：2～4周齡雄性新西蘭大白兔的骨髓細胞，分離貼壁培養(yǎng)后，培養(yǎng)至第三代。分為4個實驗組：A組培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM(空白對照

5、組)，B組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+空白殼聚糖微球的DMEM；C組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+含rhBMP-2(0.2μg/ml)的DMEM；D組培養(yǎng)液含10％胎牛血清+含rhBMP-2微球(0.2μg/ml)的DMEM。共培養(yǎng)3d后A組與B組進行流式細胞儀細胞凋亡檢測，共培養(yǎng)7、14d后，A、C及D組進行堿性磷酸酶染色及茜素紅染色。結(jié)果：A、B兩組通過流式細胞儀檢測結(jié)果無明顯差異，未引起明顯的細胞凋亡。C組及D組誘導分化7天后通過堿性磷酸酶

6、染色均為陽性，C組及D組無明顯差異。14天后C組及D組茜素紅染色均為陽性，可見紅色鈣結(jié)節(jié)形成，D組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目顯著高于C組。結(jié)論：通過乳化交聯(lián)方法制備的殼聚糖微球具有良好的生物相容性，降解產(chǎn)物無毒副作用，殼聚糖微球可持續(xù)緩慢釋放具有生物活性的rhBMP-2，可誘導MSCs向成骨方向增殖分化。
　　3.PLGA/TCP快速成型支架復合rhBMP-2殼聚糖微球體內(nèi)成骨能力評價目的：探討rhBMP-2殼聚糖緩釋微球復合PLGA/TCP支架

7、修復骨缺損的可行性和有效性。方法:應用乳化交聯(lián)方法制備rhBMP-2殼聚糖緩釋微球，通過纖維蛋白膠將rhBMP-2殼聚糖緩釋微球復合于PLGA/TCP支架。取健康成年新西蘭大白兔45只，用牙科鉆在40只實驗動物股骨髁部制備0.6cm（直徑）×1.0cm（深度）松質(zhì)骨缺損。實驗分4組：A組：缺損組，B組：用PLGA/TCP空白支架修復骨缺損，C組：用等量rhBMP-2因子復合PLGA/TCP支架修復骨缺損，D組：用rhBMP-2殼聚糖微球

8、復合PLGA/TCP支架修復骨缺損，每組10只動物。另5只動物為正常組（E組，n=5）。應用X線、Micro-CT和組織病理學等方法檢測術(shù)后4、12周A、B、C、D組骨缺損修復效果。結(jié)果：術(shù)后4周X線片示：A組無新骨形成，B組有少量新生骨影像形成，C、D組骨缺損部位均有新骨影像形成。術(shù)后12周，Micro-CT結(jié)果顯示：D組骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁間隙等指標均顯著優(yōu)于B組和C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05

9、0），A組未檢測到上述指標。術(shù)后4周，D組可見大量骨組織形成，有部分成熟的骨小梁，PLGA/TCP支架大部分被降解、吸收；B、C、D組骨長入率分別為2.63％±0.71％、23.95％±5.28％、42.63％±8.52％，3組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.050）。術(shù)后12周，D組支架和微球完全降解，骨缺損被成熟骨取代；B、C、D組骨長入率分別為5.78％±1.21％、37.26％±6.45％、74.25％±8.91％，3組之間