Sam68對T-ALL細胞增殖和凋亡的作用研究.pdf

1、急性淋巴細胞白血病(ALL)是一種遺傳異質性疾病，以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴細胞增殖為特征，ALL通過淋巴細胞表面抗原來進行免疫學分型，大致可分為前B細胞ALL，成熟B細胞ALL和T細胞ALL。T細胞ALL(T-ALL)是起源于T細胞淋巴母細胞的遺傳異質性疾病，發(fā)生于骨髓，外周血或胸腺，淋巴結和結外組織。表達不成熟T細胞免疫表型，最常見免疫抗原為CD3，包括胞漿CD3和細胞表面CD3。T-ALL患者腫瘤細胞停滯在不同分化階段，

2、根據(jù)不同免疫表型分為四類:早期前體T-ALL，前體T-ALL，皮質T-ALL和髓質T-ALL。與B-ALL患者比較，T-ALL患者預后較差，近年隨著化療的進展，兒童T-ALL患者治愈率接近75％，成年患者為50％。這種提高主要歸功于對該病的分子遺傳學和病理學的深入理解，根據(jù)危險分層調整的治療和新型靶向藥物的出現(xiàn)。但耐藥或復發(fā)的T-ALL患者預后仍然很差。深入研究急性淋巴白血病發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制有助于血液腫瘤的臨床治療。在T-ALL

3、形成中，不同基因水平的變化協(xié)同作用更改了胸腺內T細胞異常生長、增殖、凋亡、分化的過程。多種癌基因和功能性失活突變共同參與其發(fā)生發(fā)展。T-ALL病理發(fā)展過程的遺傳多變性進一步體現(xiàn)在一些普遍存在的細胞遺傳學和分子遺傳學的改變，從而引起特定生物進程的變化，如細胞周期信號傳導通路，細胞生長和增殖，染色體重組，T細胞分化和自我更新等。
　　Sam68(Src-associated in mitosis68 kDa)屬于STAR家族，具有KH

4、、SH3等多種結構域，既是一種RNA結合蛋白，又是銜接蛋白，通過與多種蛋白和RNA相互結合，參與細胞信號轉導、RNA轉錄后修飾等分子進程，在細胞增殖、凋亡及自噬等多種細胞行為中發(fā)揮重要作用。研究表明Sam68基因的異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關系，Sam68不僅在多種腫瘤中表達增高，與腫瘤生長、侵襲、轉移、凋亡等關系密切，其在乳腺癌、腎癌等多種實體瘤細胞中的表達異常身高與臨床不良預后有關。此外，Sam68參與T細胞活化，參與TCR信號轉

5、導通路，甚至可能促進混合型白血病的惡性轉化。但是目前Sam68基因在急性T淋巴細胞白血病中的作用尚未見報道。Sam68的表達是否與T-ALL的發(fā)生、發(fā)展和維持有關，以及其在T-ALL中作用的分子機制需要進一步探索。
　　目的：
　　以急性T-ALL患者骨髓細胞和T-ALL細胞系Jurkat、CCRF-CEM為研究對象，探討Sam68異常表達對T-ALL的影響，在此基礎上研究相關調控機制，為理解T-ALL的發(fā)病機制，尋找新的治

6、療靶點提供更多研究基礎。
　　方法：
　　對2014年6月～2015年4月中國醫(yī)學科學院血液學研究所血液病醫(yī)院收治32例T-ALL患者骨髓標本進行研究，并收集9例正常人骨髓標本為對照。分離單個核細胞，應用熒光實時定量PCR方法檢測Sam68基因的表達水平。
　　1.應用熒光實時定量PCR方法和Western Blot檢測T-ALL細胞系Jurkat和CCRF-CEM中Sam68表達水平。
　　2.利用RNA干擾技

7、術，構建靶向Sam68的特異性干擾載體，穩(wěn)定轉染Jurkat和CCRF-CEM細胞，下調細胞內Sam68表達水平。利用pLKO-Tet-On質粒對目的質粒敲降作用需強力霉素誘導的特性，去除強力霉素后檢測Sam68恢復效率。利用熒光實時定量PCR方法和Western Blot檢測Sam68表達調控效率。
　　3.采用MTT實驗檢測Sam68表達變化對Jurkat和CCRF-CEM細胞生長增殖活性的影響，利用細胞集落形成實驗檢測Sam

8、68表達變化對Jurkat和CCRF-CEM細胞的單細胞克隆增殖能力。利用Hoechst染色、AnnexinⅤ/FITC-PI雙染方法檢測Sam68表達變化對Jurkat和CCRF-CEM凋亡情況的影響。利用Western Blot檢測Sam68表達變化對細胞周期和凋亡相關蛋白表達影響以及AKT/mTOR通路信號分子表達變化情況。
　　結果：
　　1.32例T-ALL患者中Sam68mRNA表達水平明顯高于正常對照組。

9、>　　2.T-ALL相關Jurkat和CCRF-CEM細胞中Sam68mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常對照。
　　3.成功構建了利用shRNA干擾技術導致Sam68敲降的穩(wěn)定Jurkat和CCRF-CEM細胞系，且Sam68表達可隨強力霉素去除而恢復。
　　4.MTT實驗結果提示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細胞生長增殖活性受到抑制，Sam68恢復后Jurkat和CCRF-CEM受抑制增殖情況明顯改善。細胞

10、集落實驗結果顯示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細胞的克隆形成能力下降，Sam68恢復后下降的克隆形成情況明顯改善。細胞凋亡實驗結果顯示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細胞凋亡明顯增加，Sam68恢復后凋亡水平下降。伴隨Sam68敲降所致上述功能變化，細胞周期相關蛋白p21表達上調，CDK2表達下降，凋亡相關蛋白Bad表達上調，Bcl-xl下調，caspase-3，caspase-9，PARP的剪切活化程度明

11、顯增加，AKT/mTOR信號通路中，p-AKT，p-FOXO1，mTOR和p-p70S6k水平明顯下調，而總的AKT，F(xiàn)OXO1和p70S6k水平無明顯變化。去除強力霉素和恢復Sam68表達后，上述蛋白均明顯恢復，與陰性對照差異不顯著，無統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　T-ALL患者、Jurkat和CCRF-CEM細胞株中均存在Sam68表達異常增高，提示Sam68可能參與T-ALL病理過程。Sam68表達變化引起了T-ALL