Wnt-β-catenin信號通路在松質骨和皮質骨的差異性表達及對骨量的影響.pdf

1、背景與目的:
　　脊柱動物的骨骼包含了松質骨和皮質骨。松質骨多存在于短骨和扁平骨以及長骨的干骺端。皮質骨多存在于長骨骨干、短骨和扁平骨的皮質。松質骨和皮質骨結構不同，機械特性和代謝特性也不盡相同。結構上，皮質骨堅硬致密，其骨單位和叢狀薄片在長骨縱向排列;松質骨則相對疏松，由各個不同方向的骨小梁構成。另外，松質骨表面積較大，血供較豐富。結構的不同導致二者機械特性的差異。相對于松質骨，皮質骨有更高的彈性模量和更高的礦化水平，因而更加堅

2、硬但同時脆性也更高。
　　另外，松質骨和皮質骨在許多生理和病理情況存在代謝差異，如糖基化、藥物代謝、對飲食以及內固定物的植入的反應。這種代謝的不同尤其表現在與骨質疏松治療密切相關的骨重塑過程。松質骨較薄，低骨量且表面積大，基質內的信號容易到達骨表面啟動骨重塑。相對的，皮質骨骨量較多、骨表面少，因此，基質深部的信號可能較難到達骨表面啟動骨重塑。
　　此外，在機械負荷下，松質骨和皮質骨骨吸收水平差異，導致了骨形成能力的不同。松質

3、骨和皮質骨骨代謝的差異可能是抗骨質疏松藥物對非椎體骨折療效欠佳的原因。造成皮質骨和松質骨之間各種差異的原因還尚未完全明了。一般認為器官或組織的功能取決于細胞功能，并被多種激素和因子通過信號通路調控。尤其是骨骼，各種調節(jié)因子最終通過相同的細胞和信號通路，導致了松質骨和皮質骨在成分、結構和代謝特性的差異。很多證據表明Wnt/β-catenin信號通路在骨發(fā)育、骨形成和骨重塑起了核心作用。因此假設長骨中皮質骨和松質骨表現出不同的骨代謝水平可能

4、是由于wnt通路中相關因子的表達水平存在差異而造成的。
　　為此開展了以下實驗:1、收集野生型小鼠脛骨干骺端的松質骨和骨干的皮質骨，分別檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子的轉錄和蛋白質表達水平。2、采用持續(xù)激活和敲除β-catenin的小鼠模型，檢測骨代謝過程中成骨細胞和破骨細胞的相關指標在松質骨和皮質骨中的表達情況。
　　方法:
　　第一部分:收集野生型小鼠脛骨的干骺端的松質骨和骨干的皮質骨，分別檢測了W

5、nt/β-catenin信號通路相關因子表達的差異。
　　1.利用實時定量PCR(Polymerase chain reaction)，檢測松質骨和皮質骨的Wnt/β-catenin信號通路相關因子Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7、Wnt10a、Wnt16、LRP5(Low-density lipoprotein receptor-related protein5)、LRP6、LRP4;β-連環(huán)蛋白(β-catenin)

6、、T細胞因子(T cell factor,TCF)。以及淋巴增強子因子(lymphoid enhancer-binding factor1，LEF-1);axin-2、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)。Wnt1誘導分泌蛋白(WNT1inducible signaling pathway protein1，WISP-1)、原癌基因(c-Myc)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)、堿性磷酸酶(Alkaline pho sph

7、atase，ALP);核因子-κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-kb ligand，RANKL)、骨保護蛋白(Osteoprotegerin，OPG)的表達水平。
　　2.利用免疫組織化學染色檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子β-catenin、成骨細胞標志物核心結合因子(Runt-related transcription factor2，Runx2)、成

8、骨相關轉錄因子抗體(Osterix，OSX)、RANKL的蛋白表達水平。
　　3.TRAP染色觀察成骨細胞和破骨細胞數量。
　　4.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng)，細胞免疫熒光檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子β-catenin、Runx2，檢測成骨細胞標記物OSX，破骨細胞標記物RANKL。
　　5.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng)，分別提取核蛋白和漿蛋白，Western bloting

9、比較β-catenin的入核比。
　　6.分別提取長骨干骺端及骨干蛋白，Western bloting比較LRP6、β-catenin、ALP、Runx2、cyclinD1、OCN的蛋白表達水平。
　　第二部分:采用激活和敲除β-catenin的小鼠模型，觀察Wnt/β-catenin信號通路相關因子在松質骨和皮質骨中的表達情況，及骨代謝水平的變化。
　　1.利用實時定量PCR，檢測松質骨和皮質骨的Wnt/β-cate

10、nin信號通路相關因子TCF、LEF-1;WISP-1、axin-2、cyclin D1、c-Myc、OCN、ALP、RANKL、OPG;
　　2.Western bloting檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子β-catenin、ALP、Runx2、cyclinD1的蛋白表達水平。
　　3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察破骨細胞數量及功能。
　　4.Micro CT掃描觀察小鼠干骺端和骨干的骨量、骨密度情況。

11、
　　結果:
　　一、Wnt/β-catenin信號通路及骨代謝的相關因子在小鼠脛骨的松質骨和皮質骨表達具有明顯的差異性。
　　1.實時定量PCR顯示:Wnt/β-catenin信號通路相關因子Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、TCF、LEF-1、WISP、axin-2、cyclin D1、c-Myc、RANKL以及成骨細胞標志物ALP、OCN在松質骨的表達水平高于皮質骨。
　　2.骨吸收方面，松質骨的

12、RANKL/OPG比值高于皮質骨，TRAP染色顯示，單位面積的松質骨的成骨細胞和破骨細胞數量高于皮質骨。
　　3.Western bloting顯示松質骨成骨細胞的β-catenin入核比高于皮質骨，松質骨的LRP6、β-catenin、ALP、Runx2、cyclin D1、OCN的表達水平高于皮質骨。
　　4、免疫組織化學染色檢測結果、細胞熒光結果進一步證實了上述結果。
　　二、持續(xù)激活β-catenin后，對松質

13、骨和皮質骨的骨代謝影響明顯不同。
　　1、在成骨細胞持續(xù)激活β-catenin后，β-catenin、TCF、LEF-1、WISP、axin-2、cyclin D1、c-Myc、ALP and OCN的mRNA(m-Ribonucleic acid，核糖核酸)水平上升，但松質骨的變化幅度大于皮質骨。
　　2、松質骨的成骨細胞增加以及破骨細胞數量的下降比皮質骨明顯。
　　3、松質骨骨量和骨密度增加的幅度比皮質骨大。

14、>　　三、敲除β-catenin后，松質骨的反應和骨代謝水平的下降均比皮質骨明顯。
　　1、持續(xù)敲除β-catenin后，除了RANKL/OPG比值上升外，TCF、LEF-1;WISP-1、axin-2、cyclin D1、c-Myc、OCN、ALP、RANKL、OPG的RNA表達水平下降，但松質骨的變化幅度大于皮質骨。
　　2、松質骨的成骨細胞減少及破骨細胞數量的上升比皮質骨明顯。
　　3、松質骨骨量下降的幅度比皮質