免疫性血小板減少癥一線治療策略和P-gp在激素抵抗中的機制研究.pdf

1、免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種獲得性的自身免疫異常綜合征，約占臨床出血性疾病的1/3。經(jīng)典的ITP發(fā)病機制主要是血小板特異性自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多。近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞毒性T細胞直接殺傷血小板以及血小板去唾液酸化并在肝內(nèi)清除也是ITP血小板減少的重要途徑。此外，血小板特異性自身抗體和細胞毒性T細胞都能夠抑制ITP患者骨髓巨核細胞的成熟和凋亡，導(dǎo)致血小板生成減少。
　　ITP的

2、發(fā)病涉及極其復(fù)雜的上游自身免疫失調(diào)，基本機制是自身免疫的失耐受，糖皮質(zhì)激素對ITP的自身免疫紊亂狀態(tài)具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。ITP患者存在自身反應(yīng)性T、B淋巴細胞凋亡障礙，導(dǎo)致異常長生存，體外實驗中地塞米松可通過抑制BAFF逆轉(zhuǎn)這種異常。ITP中還存在自身反應(yīng)性免疫細胞亞群和保護性亞群之間的失平衡，包括Th1/Th2失衡、Th1/Th17/Treg失衡等。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠恢復(fù)Th1/Th2平衡以及Th17和Treg細胞的正常數(shù)量和功能，

3、還能促進保護性亞群CD8+ Treg以及CD5+ Breg細胞的功能。此外，地塞米松能夠調(diào)節(jié)ITP患者抗原呈遞細胞表面功能性分子基團間的失平衡，有助于重建患者自身免疫耐受。
　　糖皮質(zhì)激素是國內(nèi)外ITP診療指南一致推薦的成人ITP一線治療方案，包括常規(guī)劑量潑尼松治療和大劑量地塞米松沖擊治療。潑尼松治療的早期有效率在2/3左右，但長期有效率較低，且由于多數(shù)患者進行長期的持續(xù)用藥，易產(chǎn)生激素相關(guān)的不良反應(yīng)。單臂研究顯示大劑量地塞米松治

4、療新診斷的ITP早期有效率能達到80％以上，起效迅速且不良反應(yīng)輕微，有望在改善療效的同時縮短用藥周期并降低不良反應(yīng)。然而此前研究均未直接對比兩種治療方案的療效和安全性，因此目前仍然需要前瞻性、隨機對照研究來提供可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，以闡明哪種方案應(yīng)作為ITP一線治療的首選。
　　部分患者對糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)不佳或短期內(nèi)復(fù)發(fā)，這種現(xiàn)象稱為激素抵抗?？朔に氐挚宫F(xiàn)象，進一步提高糖皮質(zhì)激素用于ITP一線治療的療效，具有重要的臨床價值。P-

5、糖蛋白由多藥耐藥基因MDR-1編碼，具有ATP依賴的藥物轉(zhuǎn)運泵活性，其過表達或功能上調(diào)是導(dǎo)致多種自身免疫性疾病激素抵抗發(fā)生的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) P-gp表達顯著上調(diào)，尤其是糖皮質(zhì)激素療效不佳的患者，且PBMC對地塞米松的攝取能力顯著降低，環(huán)孢素、他克莫司等能夠抑制P-gp功能，恢復(fù)對地塞米松的攝取能力。因此

6、，P-gp在ITP激素抵抗中的作用和機制值得探索。
　　本研究應(yīng)用前瞻性、多中心、隨機對照研究的方法，通過對比大劑量地塞米松和常規(guī)劑量潑尼松兩種治療方案的療效和安全性，為ITP一線治療策略的優(yōu)化提供了高等級的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。同時檢測并分析了患者大劑量地塞米松療效和PBMC細胞P-gp表達以及細胞對地塞米松攝取能力之間的關(guān)系，并嘗試應(yīng)用環(huán)孢素調(diào)節(jié)P-gp功能，揭示了ITP中激素抵抗的機制和潛在的干預(yù)途徑。
　　第一部分:大劑量地

7、塞米松對比常規(guī)劑量潑尼松用于成人原發(fā)免疫性血小板減少癥一線治療的前瞻性、多中心、隨機對照研究
　　目的:
　　對比大劑量地塞米松和常規(guī)劑量潑尼松治療成人原發(fā)性ITP的早期療效，包括有效率和起效時間;對比兩種藥物的遠期療效，包括隨訪半年的持續(xù)緩解率及評價生存曲線;評價兩種藥物治療中患者的不良反應(yīng)和耐受性，對比其安全性;評價出血癥狀的轉(zhuǎn)歸和對早期療效的預(yù)后價值;評價血小板特異性自身抗體對療效的預(yù)后價值。從而為ITP一線治療策略的

8、優(yōu)化提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，并探索糖皮質(zhì)激素治療的預(yù)后因素。
　　方法:
　　1.將未接受過正規(guī)治療的新診斷的ITP患者按照1∶1的比例隨機分配至大劑量地塞米松組和常規(guī)劑量潑尼松組。
　　2.地塞米松組給予地塞米松口服40mg/d，連用4天為1個周期，第1個周期治療無效的患者于第10d后加用1個周期;潑尼松組給予潑尼松1.0mg/kg·d口服，連用28天，其后有效患者快速減量至最小維持劑量(＜15mg/d)或停藥，無效患者則

9、快速減量至停用。
　　3.主要研究終點是早期有效率和持續(xù)有效率。早期有效率的評價依據(jù)最新國內(nèi)外ITP診療指南，持續(xù)有效率定義為獲得早期有效后，外周血小板計數(shù)連續(xù)六個月維持在30×109/L以上，且沒有出血癥狀或者ITP特異性附加治療需求。次要研究終點包括出血評分、起效時間、療效維持時間和不良反應(yīng)等。
　　4.采用改良MAIPA技術(shù)檢測患者治療前外周血小板特異性自身抗體GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ。
　　結(jié)果:
　

10、　1.地塞米松組早期總有效率和完全反應(yīng)(complete response，CR)率均顯著高于潑尼松組，且起效時間較潑尼松組更為迅速。在地塞米松組，對第1個周期無效的患者加用第2個周期治療能夠顯著提高有效率，但是在第2個周期起效的患者獲得CR的可能性低于在第1個周期就起效的患者。
　　2.治療前外周血小板計數(shù)低于10×109/L的患者出血癥狀明顯較嚴(yán)重，治療后地塞米松組出血例數(shù)顯著低于潑尼松組。治療前出血評分＞8分是早期療效的不良

11、預(yù)后因素。
　　3.兩組患者隨訪半年的持續(xù)有效率無統(tǒng)計學(xué)差異，早期獲得CR是進而獲得持續(xù)有效的陽性預(yù)后因素。生存分析顯示兩組遠期結(jié)局相當(dāng)，早期獲得CR的患者復(fù)發(fā)率顯著較低。
　　4.血小板特異性自身抗體GPⅡb/Ⅲa陽性的患者基線血小板數(shù)更低，治療前出血癥狀更嚴(yán)重。兩種抗體陽性均提示患者獲得持續(xù)有效的可能性降低。
　　5.地塞米松組不良反應(yīng)的發(fā)生少于潑尼松組。
　　結(jié)論:
　　1.1或2個周期的大劑量地塞米

12、松治療成人新診斷的ITP具有起效迅速，早期有效率高的優(yōu)點，長期有效率與傳統(tǒng)潑尼松治療相當(dāng)。
　　2.大劑量地塞米松治療患者耐受性優(yōu)于傳統(tǒng)潑尼松治療，患者能夠在保證長期有效率的前提下規(guī)避長期的激素負荷及相關(guān)不良反應(yīng)風(fēng)險。
　　3.大劑量地塞米松有望成為ITP一線治療的首選方案。
　　第二部分:P-gp介導(dǎo)免疫性血小板減少癥中激素抵抗的作用和機制研究
　　目的:
　　分別檢測P-gp在ITP患者PBMC細胞以及

13、外周CD4+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞表面的表達水平，并根據(jù)大劑量地塞米松療效分層分析;建立超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography, UPLC）檢測細胞培養(yǎng)液中地塞米松濃度的方法學(xué)體系，評價PBMC細胞對培養(yǎng)液中地塞米松的攝取能力;研究環(huán)孢素對體外培養(yǎng)的PBMC細胞P-gp的抑制作用。從而明確P-gp數(shù)量和功能在ITP激素抵抗中的作用和機制，并探索逆轉(zhuǎn)激素抵抗作用的途徑。<

14、br>　　方法:
　　1.采集擬進行大劑量地塞米松治療的新診斷的ITP患者及健康志愿者的外周血，并分離PBMC細胞。
　　2.以PE-CD4、APC-CD19和FITC-P-gp單克隆抗體標(biāo)記PBMC細胞，流式細胞術(shù)檢測ITP患者和健康志愿者PBMC細胞、CD4+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞表面的P-gp表達水平。
　　3.將ITP患者和健康志愿者PBMC細胞分別與地塞米松或地塞米松+環(huán)孢素進行體外共培養(yǎng)，收集細胞

15、和培養(yǎng)液上清。
　　4.建立UPLC法檢測細胞培養(yǎng)液地塞米松殘余濃度的方法學(xué)體系，使用系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行線性檢驗以及回收率、精密度和穩(wěn)定性考察。
　　5.流式細胞學(xué)檢測培養(yǎng)后的PBMC細胞、CD4+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞表面的P-gp表達水平。UPLC檢測細胞培養(yǎng)液中地塞米松殘余濃度。
　　結(jié)果:
　　1.ITP患者PBMC細胞、CD4+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞表面的P-gp表達水平均顯著高

16、于健康志愿者，大劑量地塞米松治療無效的患者P-gp表達水平高于有效患者。
　　2.PBMC細胞和地塞米松或環(huán)孢素共培養(yǎng)后，表面P-gp表達水平較培養(yǎng)前無明顯變化。
　　3.ITP患者PBMC細胞培養(yǎng)后培養(yǎng)液中地塞米松殘余濃度明顯高于健康對照，大劑量地塞米松治療無效患者的PBMC細胞培養(yǎng)后地塞米松殘余濃度顯著高于有效患者。
　　4.環(huán)孢素明顯降低ITP患者PBMC細胞培養(yǎng)后培養(yǎng)液中地塞米松的殘留濃度，培養(yǎng)中加入環(huán)孢素后，